脂多糖對甲狀腺上皮細胞增殖、吞噬及胞內活性氧產生的影響

羅旋， 牟笑， 鄭婷婷， 董昕， 劉寶翠， 毛朝明

(江蘇大學附屬醫院核醫學科， 江蘇 鎮江 212001)

橋本甲狀腺炎是一種常見的器官特異性自身免疫性疾病，主要特點是甲狀腺特異性T淋巴細胞和其他免疫細胞大量浸潤甲狀腺組織，以及甲狀腺上皮細胞(thyroid follicular cells, TFCs)的破壞，最終導致甲狀腺功能減退[1]。近年來研究表明，該病的發生與遺傳、吸煙、過量碘的攝入及感染等有密切的關系[2-6]。

脂多糖是革蘭陰性細菌細胞壁的主要致病成分，可以誘發多種炎性反應。已有實驗證明脂多糖可以破壞T、B淋巴細胞對鼠甲狀腺免疫蛋白的耐受進而促進橋本甲狀腺炎的發生[7-8]，但是確切的機制尚不清楚。本研究分析脂多糖對TFCs的增殖、凋亡、吞噬及胞內活性氧產生的影響，探討脂多糖在橋本甲狀腺炎發病中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

TFCs系Nthy-ori 3-1細胞購于ECACC細胞中心。胎牛血清、RPMI-1640培養基(Gibco公司)。脂多糖(Sigma公司),熒光微球(nile red fluorescent FluoSpheres? beads)為BD公司產品，MTT(上海碧云天生物公司)，AnnexinV Alexa Fluor 647/PI凋亡檢測試劑盒(南京福麥斯生物公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 Nthy-ori 3-1細胞用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養基(含100 μg·L-1鏈霉素、100 IU·L-1青霉素)，置于37 ℃、5% CO2的培養箱培養。

1.2.2 MTT法檢測Nthy-ori 3-1細胞增殖活性 將處于對數生長期的Nthy-ori 3-1細胞以每孔3.5×103個接種于96孔板中，每組設5個復孔，每孔加入200 μL含10%胎牛血清的RPMI-1640培養基(含100 μg·L-1鏈霉素、100 IU·mL-1青霉素)，置于5% CO2培養箱培養。第2天，濃度梯度組分別加入0、10、20、100、150 ng·mL-1的脂多糖處理Nthy-ori 3-1細胞48 h；時間梯度組加入100 ng·mL-1的脂多糖分別處理Nthy-ori 3-1細胞24 h和48 h。處理結束后，棄去上清液，每孔加入終濃度為0.5 mg·L-1的MTT培養基100 μL，置于5% CO2培養箱孵育4 h。棄去上清液，每孔加入100 μL DMSO振蕩5～10 min，使結晶充分溶解。用酶聯免疫分析儀(EXL800)測定490 nm波長各孔光密度(D)值。每組實驗重復3次，計算細胞增殖率，細胞增殖率(%)=D實驗組/D對照組×100%。

1.2.3 流式細胞術檢測Nthy-ori 3-1細胞的凋亡 根據細胞增殖的實驗結果，選擇100 ng·mL-1的脂多糖處理Nthy-ori 3-1細胞48 h，無EDTA的胰酶消化收集細胞，250×g，離心5 min。用100 μL緩存液懸浮細胞，加入5 μL AnnexinV Alexa Fluor 647和10 μL 20 μg·mL-1的PI溶液，混勻室溫避光孵育15 min。孵育結束后，加400 μL PBS混勻，流式細胞儀檢測分析。

1.2.4 熒光微球攝入實驗評估Nthy-ori 3-1細胞的吞噬功能 實驗前1天將Nthy-ori 3-1細胞以5×105個/孔接種于6孔板中，每孔加入2 mL含0.5%胎牛血清的RPMI-1640培養基(含100 μg·L-1鏈霉素、100 IU·mL-1青霉素)，再分別加入0、10、20、100 ng·mL-1脂多糖，隨后將6孔板置于5% CO2培養箱培養12 h后，每孔加入熒光微球4 μL(終濃度為7.2×105個/mL)，置于5% CO2培養箱孵育4 h后，PBS洗3遍，收集細胞，流式細胞儀檢測熒光強度。

1.2.5 熒光探針DCFH-DA法檢測Nthy-ori 3-1胞內活性氧的水平 將Nthy-ori 3-1細胞以5×105個/孔接種于6孔板中，每孔加入2 mL含10%胎牛血清的RPMI-1640培養基(含100 μg·L-1鏈霉素、100 IU·mL-1青霉素)，將6孔板置于5%CO2培養箱培養過夜。第2天，分別加入0、10、20、100 ng·mL-1脂多糖，4 h后每孔加入終濃度為10 μmol·L-1的DCFH-DA無血清RPMI-1640培養基1 mL，37 ℃培養箱孵育20 min。用無血清RPMI-1640培養基洗滌細胞3次。收集細胞，立即用流式細胞儀檢測。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 脂多糖促進Nthy-ori 3-1細胞的增殖

用0、10、20、100、150 ng·mL-1脂多糖分別作用Nthy-ori 3-1細胞48 h后，MTT檢測結果顯示，與0 ng·mL-1脂多糖對照組比較，各處理組Nthy-ori 3-1細胞的增殖率明顯增加(F=11.43，P<0.01；圖1A)，在100 ng·mL-1脂多糖作用時增殖明顯(t=5.115,P<0.01)，且在0～100 ng·mL-1濃度范圍內呈現一定的劑量依賴性。用100 ng·mL-1脂多糖分別作用Nthy-ori 3-1細胞24 h和48 h后，與對照組相比，細胞增殖明顯(F=16.25，P<0.01；圖1B)，其中以48 h時尤甚(t=7.01，P<0.01)。

2.2 脂多糖對Nthy-ori 3-1細胞凋亡無明顯影響

用100 ng·mL-1脂多糖作用Nthy-ori 3-1細胞48 h后，流式細胞術檢測結果顯示，與0 ng·mL-1脂多糖對照組比較，100 ng·mL-1脂多糖處理組細胞凋亡率降低，但差異無統計學意義(t=1.697，P>0.05；圖2)。

A：脂多糖作用細胞48 h；B：100 ng/mL脂多糖處理細胞24 h和48 h；a：P<0.01，與0 ng/mL組比較；b：P<0.05，c：P<0.01，與0 h組比較

圖1MTT法檢測脂多糖處理后Nthy-ori3-1細胞的增殖率

圖2 流式細胞術檢測脂多糖對Nthy-ori 3-1細胞凋亡的影響

2.3 脂多糖促進Nthy-ori 3-1細胞的吞噬功能

熒光微球攝入實驗結果表明，用0、10、20、100 ng·mL-1脂多糖分別作用12 h后，Nthy-ori 3-1細胞的吞噬率明顯高于0 ng·mL-1脂多糖對照組(F=10.21，P<0.01；圖3)，在脂多糖20 ng·mL-1時達到最高峰(t=29.44，P<0.01)，提示脂多糖能促進Nthy-ori 3-1細胞的吞噬且呈一定的劑量依賴性。

a：P<0.01，b：P<0.05，與0 ng·mL-1脂多糖比較

2.4 脂多糖促進Nthy-ori 3-1細胞活性氧的產生

用活性氧檢測探針DCFH-DA的平均熒光強度(MFI)反映Nthy-ori 3-1胞內活性氧的水平。結果如圖4所示，10、20、100 ng·mL-1脂多糖作用4 h后，Nthy-ori 3-1細胞胞內活性氧水平明顯高于0 ng·mL-1脂多糖對照組(F=21.67,P<0.01)，其中以100 ng·mL-1脂多糖時最為明顯(t=10.65，P<0.01)，顯示胞內活性氧水平明顯上升。

a：P<0.01，與0 ng·mL-1脂多糖比較

3 討論

橋本甲狀腺炎是一種多因素誘導的自身免疫紊亂性疾病，機體針對自身抗原發生免疫應答，大量的淋巴細胞浸潤甲狀腺組織，導致甲狀腺功能受損，甲狀腺腫大、纖維化最終導致甲狀腺功能減退[9-10]。TFCs是構成甲狀腺組織的主要細胞，感染和過量碘的攝入可以誘導TFCs表達MHCⅡ，使其變成抗原提呈細胞，促進橋本甲狀腺炎的發生發展[11-12]。研究表明脂多糖可以促進na?ve CD4+T細胞向針對甲狀腺抗原的特異性Th17細胞分化，導致TFCs的免疫損傷，從而參與橋本甲狀腺炎的發病過程[13-14]。本研究通過體外實驗研究脂多糖對TFCs的增殖、吞噬和胞內活性氧產生能力的影響，探討脂多糖在橋本甲狀腺炎發病過程中的作用。

細胞增殖在一定程度上是細胞分化為多種功能表型的前提和基礎。在橋本甲狀腺炎的發病過程中，TFCs增殖能力的變化與發病密切相關。我們的實驗證明在100 ng·mL-1濃度范圍內脂多糖能夠促進TFCs的增殖，對TFCs的凋亡無顯著影響。這與脂多糖對免疫細胞等的促凋亡作用是不一致的。已有報道[15]，脂多糖可以活化肝癌細胞表面的TLR4受體信號通路，促進肝癌細胞的生存和增殖。出現兩種相反結論的原因可能與不同的細胞類型和不同的脂多糖作用濃度等因素相關。

高等動物的吞噬細胞通過吞噬作用，攝取和消滅感染的細菌,病毒以及損傷、衰老的細胞，是機體免受外來感染的第一道防線[16-17]。脂多糖可以增強單核-巨噬細胞的吞噬能力[18-19]，然而脂多糖對正常上皮細胞的吞噬功能的影響卻少有研究。本研究用熒光微球攝入法結合流式細胞術評價脂多糖對TFCs吞噬功能的影響，結果表明脂多糖能夠增強TFCs的吞噬功能，提示在炎癥介質介導下TFCs參與了炎癥局灶部位的炎癥反應。然而脂多糖促進TFCs吞噬功能的機制尚需進一步探討。

活性氧是超氧陰離子、過氧化氫、羥自由基、一氧化氮等一類具有很高生物活性的含氧化合物的總稱，參與細胞的增殖、凋亡、免疫及抗微生物等過程[20-21]。大量研究表明脂多糖能誘導巨噬細胞及上皮細胞產生大量的活性氧等炎性介質，進而加重局部炎性反應[22]。我們的研究結果顯示，100 ng/mL脂多糖作用4 h能明顯提高TFCs胞內活性氧的水平，從而加劇細胞的自身損傷，有助于橋本甲狀腺炎的炎癥反應和疾病發展。

綜上所述，脂多糖通過促進TFCs增殖、上調TFCs的吞噬活性和提高胞內活性氧水平從而促進橋本甲狀腺炎的炎癥反應過程，顯示了脂多糖在橋本甲狀腺炎發生、發展中的重要致病作用。

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