耐酸酵母菌株在沙棘果酒中的應用研究

胡佳星，袁文艷，楊小沖，陳忠軍*，賈美芳，高 欣，丁鵬澤，張璐瑤

（內蒙古農業大學 食品科學與工程學院，內蒙古 呼和浩特 010018）

沙棘又稱醋柳、酸刺，被譽為“二十一世紀的長生果”。在我國沙棘的食用有著悠久的歷史，早在公元8世紀《四部醫典》中就已出現關于沙棘的記載[1]。沙棘含有上百種的化合物，包括必需氨基酸、維生素、黃酮等多種活性物質[2]。沙棘中還含有較高含量的酚類和抗壞血酸，使沙棘具有較好的抗氧化和免疫功能[3-4]。除此之外，沙棘還可增加心肌細胞收縮率、改善心衰，還可降血壓、抗輻射、抗腫瘤、預防心血管疾病等[5-7]。近些年，研究人員發現沙棘及其種子的提取物還具有一定的抗菌功能[8]。馬榮山等[9]采用流加發酵的方式，經響應面法優化，將沙棘釀成了果香飽滿，酒精度為11.8%vol的沙棘果酒。徐敏等[10]為克服傳統果酒發酵時間長、發酵不易控制、風味較差等缺點采用生物降酸的方式，利用乳酸菌聯合酵母的發酵方法，制備一種新型的適合大眾飲用的沙棘酒。焦揚等[11]發現沙棘果酒對自由基有較強的清除能力，尤其對羥基的清除率最高，可達97.98%。NEGI B等[12]試驗結果表明，沙棘酒對氧化應激及高血膽固醇癥均可起到一定的保護作用[12]，具有保健功效。雖然我國已將果酒作為酒類發展重點，但與歐美、日本等發達國家相比，我國果酒的生產發展起步較晚，生產工藝技術落后[13]，在菌株的篩選、育種、釀造及陳化工藝等方面與外國均有較大的差距[14]，因此探索沙棘果酒的生產工藝對于果酒的開發具有十分重要的作用。

沙棘果漿自然pH較低，在發酵過程中，由于酵母所產有機酸的不斷積累，使得發酵液的酸度進一步增強[15]，酸度的增強不僅會影響酵母的生長繁殖，還會造成果酒酸澀、酒體粗糙等，因此選用在酸性脅迫下酵母細胞仍具備較好的細胞活性及發酵性能的酵母菌株對于沙棘果酒的生產極為重要。以沙棘為實驗原料，將實驗室保藏的能夠在pH1.8條件下存活的耐酸酵母菌株YM1-1E[16]作為發酵菌株，以感官評分及酒精度為評價指標，采用單因素及正交試驗對沙棘果酒的發酵工藝進行了研究，以期得到酒體醇厚、口感細膩、酒精度高、果香濃郁的沙棘果酒，為沙棘果酒的產業化開發提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

耐酸酵母菌株YM1-1E：本實驗室保藏；沙棘原漿：家樂福超市；檸檬酸鈉、檸檬酸（均為食品級）：大自然生物集團有限公司；蔗糖：市售；偏重亞硫酸鉀（分析純）：天津大茂試劑廠。

1.2 儀器與設備

PB-10精密電子pH計：德國Sartorius公司；SE602F電子天平：奧豪斯儀器上海有限公司；PAL-1糖度儀：日本TOKOY ATAGO公司；HZQ-F100恒溫振蕩培養箱；太倉市實驗設備廠；LRH-500F生化培養箱：上海一恒科學儀器有限公司；WZB數顯折光儀：上海儀電物理光學儀器有限公司；SW-CJ-2FD雙人單面垂直凈化工作臺：濟南來保醫療器械有限公司。

1.3 方法

1.3.1 沙棘果酒的工藝流程

沙棘原漿→調整成分（添加蔗糖將沙棘配料的糖度調整為23°Bx；以偏重亞硫酸的形式調整沙棘配料中SO2的質量濃度）→接種（菌株YM1-1E活化，制備菌懸液）→恒溫120 r/min振蕩發酵→12℃陳釀90 d→過濾澄清（通過低溫，同時添加皂土澄清劑進行澄清）→沙棘果酒

1.3.2 菌株的活化

將斜面保藏的YM1-1E菌株在無菌環境中接種于酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）液體培養基中，28℃恒溫培養48 h后，將其以2%的接種量接種到YPD液體培養基中，并在28℃的條件下培養48 h，根據以上操作再次進行傳代培養，以下實驗均使用第3代菌液。

1.3.3 制備菌懸液

將10 mL三代菌液在4 000 r/min的條件下離心3 min后倒掉上清液，并用無菌生理鹽水將離心的菌泥進行洗滌，用漩渦儀混合均勻后，依據平板菌落計數的方法，將活菌濃度調整為1×108CFU/mL。

1.3.4 沙棘果酒的生產工藝的優化

（1）沙棘與水配比：在接種量為3%，初始pH值為3.5，SO2添加量為60 mg/L的條件下，將沙棘與水按照1∶2、1∶4、1∶6、1∶8、1∶10、1∶12的體積比進行配制，在24 ℃條件下恒溫發酵10 d，以酒精度和感官評定為考察指標，分析沙棘與水的比例對沙棘果酒品質的影響。

（2）SO2添加量：在初始pH為3.5，接種量為3%，料水比為最佳的條件下，調整SO（2偏重亞硫酸）添加量分別為30 mg/L、60 mg/L、90 mg/L、120 mg/L、150 mg/L，于24 ℃條件下發酵10 d，以酒精度和感官評定為考察指標，分析SO2添加量對沙棘果酒品質的影響。

（3）初始pH：采用最佳的SO2添加量、料水比，接種量為3%，用檸檬酸和檸檬酸鈉將初始pH分別調為3.5、4.0、4.5、5.0、5.5，接種后于24℃條件下恒溫發酵10 d，以酒精度和感官評定為考察指標，分析初始pH對沙棘果酒發酵的影響。

（4）接種量：在初始pH、SO2添加量及料水比均為最佳的基礎上，按照沙棘配料體積分數的1%、2%、3%、4%、5%的接種量分別進行接種[17]，24℃恒溫發酵10 d后，以酒精度和感官評定為考察指標，分析接種量對沙棘果酒發酵的影響。

（5）發酵溫度：在料水比、接種量、初始pH以及SO2添加量均為上述試驗最佳的條件下，將沙棘配料分別放在20℃、22℃、24℃、26℃、28℃的溫度條件下恒溫發酵10d，以酒精度和感官評定為考察指標，分析發酵溫度對沙棘果酒發酵的影響。

（6）發酵時間：采用已確定的接種量、配料初始pH、料水比及SO2添加量，按照最佳的發酵溫度恒溫發酵6 d、8 d、10 d、12 d、14 d，以酒精度和感官評定為考察指標，分析發酵時間對沙棘果酒品質的影響。

1.3.5 指標檢測方法

感官評定方法：邀請13位實驗室成員對發酵后的沙棘果酒進行品嘗，以表1為感官評定標準對沙棘果酒進行感官評價，評定分數為100分制，感官評價最終得分為13人評分的平均值。

表1 沙棘果酒感官評定標準Table 1 Sensory evaluation standards of seabuckthorn wine

可溶性浸出物含量：采用數顯式折光儀進行檢測；殘糖含量：使用便攜式手持糖度計進行測定；酒精度：依據國標GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》酒精計法[18]測定；糖醇轉化率計算公式如下[19]：

式中：S指糖醇轉化率，%；C指酒精度，%vol；G指糖度，°Bx。

1.3.6 數據處理

以上實驗均重復3次，實驗所得數據均采用Excel軟件處理與分析。

2 結果與分析

2.1 沙棘果酒發酵工藝研究單因素試驗

2.1.1 沙棘與水的體積比對沙棘果酒品質的影響

圖1 沙棘原漿與水的體積比對沙棘果酒品質影響Fig.1 Effect of seabuckthorn pulp to water volume ratio on seabuckthorn wine quality

由圖1可知，不同沙棘與水體積比對沙棘果酒品質的影響比較明顯，隨著沙棘與水體積比的增大，酒精度呈現先增后減的趨勢。沙棘原漿濃度過大使得沙棘配料滲透壓增大，酵母細胞失水，抑制了細胞的代謝活動，所產果酒酒精度偏低。沙棘原漿與水體積比在1∶6的條件下，發酵的沙棘果酒酒精度與感官評分均達到最大，分別為11.4%vol和82.3分。隨著水比例的增大，沙棘原漿中的組分被稀釋，原漿濃度降低，導致發酵液中的營養成分無法滿足酵母的增殖與發酵需要，因而隨著沙棘配料中水比例的增加酒精度逐步遞減。所以沙棘原漿與水最佳的體積比為1∶6。

2.1.2 SO2添加量對沙棘果酒品質的影響

圖2 SO2添加量對沙棘果酒品質影響Fig.2 Effect of SO2addition on seabuckthorn wine quality

由圖2可知，SO2添加量過高或過低均會影響沙棘果酒的品質。適量的SO2能夠起到一定的抗氧化作用，避免果酒因氧化而變色，同時還可抑制雜菌的生長，但較低的SO2質量濃度不能有效地抑制雜菌的生長和沙棘果漿的氧化，雜菌對營養物質的消耗及次級代謝產物的分泌，使得沙棘果酒酒精度偏低，風味較差；同時高質量濃度的SO2對會酵母自身的生長及發酵性能產生抑制作用，使沙棘果酒具有刺鼻性氣味，影響果酒的風味和口感[20]。當SO2添加量為30～120mg/L時，沙棘果酒酒精度與感官評分均隨SO2添加量的增加而增大；當SO2添加量為120 mg/L時，沙棘果酒酒精度與感官評分均達到最大，分別是11%vol和85.0分；當SO2添加量＞120 mg/L之后，沙棘果酒酒精度與感官評分均隨之下降。所以沙棘果酒發酵最適宜的SO2添加量為120 mg/L。

2.1.3 初始pH對沙棘果酒品質的影響

圖3 初始pH對沙棘果酒品質的影響Fig.3 Effect of initial pH on seabuckthorn wine quality

由圖3可知，當初始pH值為3.5～5.5時，隨著初始pH增大，酵母生長良好，其發酵性能逐漸提高，酒精度及感官評分呈上升趨勢；當初始pH值為5.0時，沙棘果酒酒精度與感官評分均達到最大，分別為11.9%vol和87.5分；當初始pH＞5.0時，沙棘果酒酒體渾濁，色澤變暗，口感變差，酒精度下降，因為過高的pH使沙棘果漿中的部分營養成分變性，破壞了其中的營養物質，果漿顏色變暗，從而降低沙棘果酒的品質，因此選擇沙棘配料最佳的初始pH值為5.0。

2.1.4 接種量對沙棘果酒品質的影響

圖4 接種量對沙棘果酒品質影響Fig.4 Effect of inoculum on seabuckthorn wine quality

由圖4可知，但接種量在1%～3%時，酒精度及感官評分隨接種量的增加呈上升趨勢；當接種量為3%時，沙棘果酒的感官評分與酒精度均為最高分別為11.7%vol和84.0分。在一定程度上擴大接種量不僅可加速酵母繁殖，還能夠提高沙棘果酒的發酵速度。當接種量過大（＞3%）時，沙棘果酒的感官評分與酒精度會隨之降低，因為酵母加量過大時發酵液中的營養物質消耗大部分用于酵母的生長繁殖，以致沒有足夠的糖分可轉化為酒精，使酒精度降低。同時過量的酵母還會使果酒出現酵母異味，掩蓋沙棘果香，使果酒的口感及風味變差[21]。因此選擇沙棘果酒釀造最佳的接種量為3%。

2.1.5 發酵溫度對沙棘果酒品質的影響

圖5 發酵溫度對沙棘果酒品質影響Fig.5 Effect of fermentation temperature on seabuckthorn wine quality

由圖5可知，隨著發酵溫度的升高，沙棘果酒酒精度與感官評分均呈現先上升后下降的趨勢。當發酵溫度為16℃時，沙棘果酒的感官評分與酒精度均較低，在低溫條件下，菌株生長較慢，代謝速率偏低，發酵不足。在發酵溫度為24℃時，沙棘果酒的酒精度為11.7%vol，略低于發酵溫度為28℃時的葡萄酒，但其口感及風味較好，感官評分較高。隨著發酵溫度的升高，發酵速率加快，使得酵母過早的衰敗導致發酵終止[22]，因此感官品評分呈現下降趨勢。當發酵溫度控制在24℃時，釀制的沙棘果酒果香飽滿、口感柔和，因此選擇沙棘果酒最佳的發酵溫度為24℃。

2.1.6 發酵時間對沙棘果酒品質的影響

圖6 發酵時間對沙棘果酒品質影響Fig.6 Effect of fermentation time on seabuckthorn wine quality

由圖6可知，沙棘果酒的酒精度及感官評分伴隨著發酵時間在6～10d范圍內的延長呈上升趨勢；當發酵10d時，所釀沙棘果酒酒體協調、酸甜適中，并且有明顯的沙棘果香，酒精度可達11.8%vol；發酵10 d后，發酵停止，此后的沙棘果酒酒精度與感官評分無明顯差異，因此選擇沙棘果酒最佳發酵時間為10 d。

2.2 發酵工藝優化正交試驗

通過對單因素水平試驗進行分析，選擇對沙棘果酒品質影響較顯著的接種量（A）、SO2添加量（B）、發酵溫度（C）及初始pH（D）作為影響沙棘果酒發酵的主要因素，固定發酵時間為10 d，沙棘與水的體積比為1∶6，依據試驗因素與水平（表2）設計L9（34）正交試驗，以沙棘果酒的酒精度及感官評定為評價指標，確定沙棘果酒最佳的發酵工藝。正交試驗因素與水平見表2，結果與分析見表3。

表2 發酵工藝優化正交試驗因素與水平Table 2 Factors and levels of orthogonal experiments for fermentation technology optimization

表3 發酵工藝優化正交試驗結果與分析Table 3 Results and analysis of orthogonal experiments for fermentation technology optimization

由表3可知，當以酒精度為評價指標分析時，對4個因素極差進行比較，極差R的重要次序為：發酵溫度＞初始pH＞接種量＞SO2添加量，表明發酵溫度對沙棘果酒品質的影響最大。當從感官評定為評價指標進行分析時，由極差R可知各因素對沙棘果酒感官影響次序為：初始pH＞發酵溫度＞接種量=SO2添加量，表明初始pH對沙棘果酒品質的影響最大。結果顯示沙棘果酒釀造的最優工藝組合為A2B1C3D3，即沙棘與水的體積比為1∶6，酵母菌接種量3.0%，SO2添加量105 mg/L，初始pH 5.3，發酵溫度25 ℃發酵10 d。在此最佳發酵條件下進行3次驗證試驗，得到的沙棘果酒色澤均勻、果香濃郁、口感細膩、有明顯的酒香味，酒精度為12.7%vol，殘糖為5.6°Bx，糖醇轉化率可達48.75%，感官評分為89.0分。

2.3 沙棘果酒質量指標

2.3.1 感官指標

色澤：呈金黃色、色澤均勻、酒體協調、無雜色現象、無沉淀與分層現象；風味：具有沙棘特有的風味，果香飽滿濃郁、無異味；口感：醇綿可口、酸甜適中、細膩柔和。

2.3.2 理化指標

酒精度：12.7%vol；殘糖含量：5.6°Bx；可溶性固形物含量：18.4%。

2.3.3 衛生指標

細菌總數≤100 CFU/mL；大腸桿菌≤3 MPN/100 mL；致病菌未檢出。符合國標GB/T 5009.49—2008《發酵酒及其配制酒衛生標準的分析方法》。

3 結論

本研究以實驗室保存的耐酸酵母菌株YM1-1E為試驗菌株，將其應用于沙棘果酒的發酵，經單因素及正交試驗得到沙棘果酒最佳的生產工藝條件為沙棘與水的體積比為1∶6，發酵溫度25℃，酵母菌接種量3.0%，SO2添加量105mg/L，沙棘配料初始pH 5.3，發酵時間10 d。在此優化工藝條件下發酵的沙棘果酒，酒體協調、色澤均勻、果香飽滿、口感酸甜，酒精度為12.7%vol，感官評分為89.0分。理化指標與衛生指標均達到國家相關標準要求，對沙棘果酒的研發與生產有一定的參考價值。

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