分段調控pH值對陰溝腸桿菌WL1318發酵棉稈水解糖液產氫的影響

屈曉偉，李艷賓，2，張 琴，2*

（1.塔里木大學 生命科學學院，新疆 阿拉爾 843300；2.塔里木大學 塔里木盆地生物資源保護利用兵團重點實驗室，新疆 阿拉爾 843300）

氫能是地球上最清潔的終極能源，目前已成為世界各國競相開發的可再生能源。近年來，通過產氫微生物發酵木質纖維素水解液生產生物氫已引起了廣泛地關注[1-5]。其中，產氫微生物在發酵產氫過程中起到了主導作用，自然界的發酵產氫微生物主要包括專性厭氧發酵產氫菌、兼性厭氧發酵產氫菌和需氧發酵產氫菌[6-11]。兼性厭氧發酵產氫菌中的腸桿菌屬（Enterobacter）是目前研究最多的產氫細菌，能夠通過分解甲酸的代謝途徑產氫，即通過混合酸發酵途徑產氫[12-13]。該屬細菌在發酵產氫過程中會伴隨多種有機酸（如乳酸、乙酸等）的產生，使發酵液pH值降低。

pH值是影響發酵產氫過程的重要因素，能影響產氫菌的活力和發酵產氫代謝過程[14]。發酵過程的pH調控直接影響產氫菌一些有機酸類代謝物（如乳酸、乙酸等）的濃度，有利于生物氫的合成[15]。QIU C S等[16]研究了pH和基質濃度對極端嗜熱菌群發酵產氫的影響，發現菌群最適的發酵產氫起始pH在中性范圍（pH6.0～7.0），在起始pH7.0、木糖質量濃度7.5g/L時獲得最高的生物氫產量（1.29 mol H2/mol消耗的木糖）。KHANNA N等[13]調控Enterobacter cloacaeIIT-BT 08發酵葡萄糖產氫過程中pH值恒定為6.5，獲得了較高的生物氫產量（3.1 mol H2/mol葡萄糖）、特異產氫潛力

收稿日期：2018-01-26 修回日期：2018-04-26

基金項目：國家自然科學基金資助項目（21406150）

作者簡介：屈曉偉（1992-），男，碩士研究生，研究方向為產氫微生物發酵產氫及代謝調控。

*通訊作者：張 琴（1980-），女，副教授，博士，研究方向為產氫微生物及其代謝工程改造。798.1 mL/g）和特異產氫速率（72.1 mL（/L·h·g））。

棉稈是新疆分布最廣泛的生物質原料，用棉稈水解糖液發酵產氫已成為棉稈高值化利用的重要方式之一，然而，目前棉稈水解糖液發酵產氫僅限于產氫動力學等基本特性的研究[17]，尚未實現對其發酵過程的有效調控。本研究通過研究分段調控pH值對Enterobacter cloacaeWL1318發酵棉稈水解糖液產氫過程中發酵液pH值、生物氫合成、棉稈水解糖液中葡萄糖和木糖利用、菌株生長的影響，以期為有效調控該菌株發酵棉稈水解糖液產氫的過程提供理論指導和技術參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

陰溝腸桿菌（Enterobacter cloacae）WL1318：由塔里木盆地生物資源保護利用兵團重點實驗室保藏；棉稈原料：采自新疆阿拉爾棉田，風干、粉碎、過篩后經水解獲得水解糖液用于發酵產氫實驗。

1.1.2 主要試劑

葡萄糖、木糖、牛肉膏、蛋白胨、3,5-二羥基甲苯（地衣酚）、3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）、酒石酸鉀鈉、瓊脂粉、重蒸酚：生工生物工程（上海）股份有限公司；NaCl、KH2PO4、MgSO4·7H2O、NaCl、FeCl3、濃鹽酸、濃硫酸、NaOH（均為分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；大孔吸附樹脂LS808：陜西藍深特種樹脂有限公司。

1.1.3 培養基

斜面活化培養基：D-木糖10 g，葡萄糖10 g，牛肉膏5 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，KH2PO40.5 g，MgSO·47H2O 1 g，瓊脂22 g，pH7.0，水1 000 mL，110 ℃滅菌30 min。

種子培養基：D-木糖10 g，葡萄糖10 g，牛肉膏5 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，KH2PO40.5 g，MgSO4·7H2O 1 g，pH 7.0，水1 000 mL，110℃滅菌30 min。

發酵培養基：棉稈酸解糖液1 000 mL，牛肉膏5 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，KH2PO40.5 g，MgSO·47H2O 0.5 g，pH 7.5，110℃滅菌30min。棉桿水解糖液初始糖濃度調節為40g/L。

1.2 儀器與設備

LDZX-50KB立式電熱壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫療器械廠；SW-CJ-2F超凈工作臺、HPX-9272MBE數顯電熱培養箱、GZX-9140MBE數顯鼓風干燥箱、SHZ-D（Ⅲ）循環水式真空泵：鞏義市予華儀器有限責任公司；UV754N紫外-可見分光光度計：上海精密科學儀器有限公司；RE-52CS旋轉蒸發儀：上海亞榮生化儀器公司；PHS-3C精密酸度計：上海儀電科學儀器股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 棉稈水解糖液制備方法

棉稈水解糖液制備參照ZHANG Q等[18]報道的棉稈酸解優化工藝進行制備：過篩的棉稈（20目）采用4%（V/V）稀硫酸溶液按照固液比1∶5（g∶mL）于121 ℃水解30 min，抽濾得到棉稈的酸水解液。酸水解液經NaOH和Ca（OH）2（1∶3，物質的量比）沉淀、4%H2SO4回調脫毒，大孔吸附樹脂脫色，得到一定濃度脫毒、脫色的棉稈水解糖液，再經旋轉蒸發儀濃縮至所需糖濃度備用。

1.3.2 菌種的活化與接種

挑取2～3環活化的斜面菌種接種至種子培養基，250mL三角瓶裝液量為100 mL，于37℃、120 r/min振蕩培養15～16 h。調節種子液OD600nm為0.8～1.0，按10%（V/V）接種量接種于發酵培養基中，密封好發酵裝置并連接好各導氣管（500 mL自制產氫發酵裝置裝液量為350 mL，每個處理3個重復），置于37℃恒溫培養箱中培養。

1.3.3 生物氫收集和檢測方法

采用排氫氧化鈉溶液法[20]收集并檢測氫氣體積，每24h收集并檢測3次氫氣體積，累加計為日均產氫量。每24 h取8 mL發酵液，2 mL用于測定菌體OD600nm，1 mL通過稀釋平皿計數法檢測活菌數，剩余5 mL置于離心管中，4 000 r/min離心20 min，取上清液，檢測葡萄糖和木糖的質量濃度。

1.3.4 分析檢測方法

棉稈水解糖液及發酵液中葡萄糖和木糖質量濃度分別采用DNS比色法[19]和地衣酚比色法[21]測定。培養基和發酵液的pH值采用精密酸度計測定。葡萄糖和木糖利用率：采用發酵過程中消耗的葡萄糖（或木糖）質量濃度占初始葡萄糖（或木糖）質量濃度的百分比來表示。

1.3.5 計算公式和分析軟件

采用Gompertz模型對不同處理下的累積產氫量進行擬合[22]，方程如下所示：

式中：H為累積產氫量，mL/L；P表示產氫潛力，mL/L，Rm為最大產氫速率，mL（/L·h），λ為延滯期時間，h，e為自然常數，2.718 28；式中P、Rm和λ值通過Sigmaplot 12.0軟件進行計算和分析。

各處理數據通過Origin 8.0軟件計算、分析并作圖。

2 結果與分析

2.1 分段調控pH值對E.cloacaeWL1318發酵棉稈水解糖液產氫過程中發酵液pH值的影響

檢測了不同pH值分段調控處理下，E.cloacaeWL1318發酵棉稈水解糖液產氫過程中的發酵液pH值變化，結果如圖1所示。

由圖1可知，未進行pH調控的處理組，盡管發酵液初始pH值調節為7.5，但其pH值在發酵產氫過程中卻急劇下降，發酵48 h，發酵液pH值＜5.0，至發酵結束（120 h），發酵液pH值＜4.0。在分段調控pH值的處理中，自調控時間點起，發酵pH值調為初始pH值（7.5），之后發酵液pH值也隨發酵時間降低，但降低的幅度仍然小于未調控處理的，并且48 h調控組的pH值降低幅度小于28 h調控組的，這兩個pH值調控組至發酵結束（120 h）時，發酵液pH值均能維持在5.0左右。由此可見，E.cloacaeWL1318發酵棉稈水解糖液產氫過程中，適當進行pH值調控，可控制發酵液pH值不會急劇降低。

圖1 分段調控pH值對E.cloacaeWL1318發酵棉稈水解糖液產氫過程中發酵液pH值的影響Fig.1 Effect of subsection control of pH value on pH value of fermentative broth in the hydrogen production process of cotton stalk hydrolysate fermentation byE.cloacae WL1318

2.2 分段調控pH值對E.cloacaeWL1318發酵棉稈水解糖液產氫過程中生物氫合成的影響

對E.cloacaeWL1318發酵棉稈水解糖液產氫過程中的日均產氫量進行了監測，結果如圖2所示。

圖2 分段調控pH值對E.cloacaeWL1318發酵棉稈水解糖液產氫過程中日均產氫量的影響Fig.2 Effect of subsection control of pH value on daily average hydrogen yield in the hydrogen production process of cotton stalk hydrolysate fermentation byE.cloacae WL1318

由圖2可知，發酵前48 h，分段調控pH值處理和未調控處理的日均產氫量沒有顯著差異（P＞0.05）。發酵48 h后，分段調控pH值處理的日均產氫量顯著提高（P＜0.05），尤其48 h調控pH值的處理提高幅度較大，發酵72 h的日均產氫量相較未調控處理的提高約1.5倍。至發酵結束（120 h），24 h調控pH值和48 h調控pH值處理的日均產氫量接近，均高于未調控處理的。可見，調控pH值處理有效提高了發酵液pH值和菌株的日均產氫量，說明E.cloacaeWL1318發酵棉稈水解糖液產氫過程中進行pH調控可有效促進菌株生物氫的合成。

日均產氫量按發酵時間累加，統計了E.cloacaeWL1318發酵棉稈水解糖液120 h的累積產氫量，統計結果見圖3。由圖3可知，發酵48 h后，分段調控pH值處理顯著提高了菌株的累積產氫量（P＜0.05）。至發酵結束（120 h），24 h調控pH值和48 h調控pH值處理的累積產氫量相較未調控處理的分別提高了約15%和30%，表明調控pH值處理有利于菌株累積合成氫氣，對菌株生物氫的合成起到了正調控作用。

圖3 分段調控pH值對E.cloacaeWL1318發酵棉稈水解糖液產氫過程中累積產氫量的影響Fig.3 Effect of subsection control of pH value on cumulative hydrogen yield in the hydrogen production process of cotton stalk hydrolysate fermentation byE.cloacae WL1318

采用Gompertz模型對不同處理下的累積產氫量進行擬合，并對其中的參數P、Rm和λ值進行計算，并計算模型的相關系數R2，結果見表1。由表1可知，在各處理條件下，相關系數R2均＞0.99，說明各處理組的累積產氫量可充分通過Gompertz模型進行擬合。24 h調控pH值和48 h調控pH值處理的產氫潛力P均高于未調控處理的，說明在發酵的一定階段調控發酵液pH值可提高菌株的產氫潛力，有利于生物氫的合成。最大產氫速率Rm以24 h調控pH值的處理最高，說明在發酵24h調控pH值能促進生物氫的快速合成。24h調控pH值和48 h調控pH值處理的延滯期λ均較未調控處理的長，說明菌株在一定pH值調控處理下，通過延長延滯期、推遲生長峰期來適應厭氧發酵產氫過程，從而提高自身產氫潛力，以提高生物氫的合成量。

表1 不同pH值調控方式下Gompertz模型擬合累積產氫量的參數和相關系數Table 1 Parameters and correlation coefficients of Gompertz model fitted cumulative hydrogen yield in different pH value control methods

2.3 分段調控pH值對E.cloacaeWL1318發酵棉稈水解糖液產氫過程中棉稈水解糖液中葡萄糖和木糖利用的影響

檢測了不同pH值分段調控處理下，E.cloacaeWL1318發酵棉稈水解糖液產氫過程中的葡萄糖和木糖質量濃度變化，并換算了全發酵過程中的葡萄糖和木糖利用率，結果如圖4所示。

圖4 分段調控pH值對E.cloacaeWL1318發酵棉稈水解糖液產氫過程中葡萄糖（A）和木糖（B）利用的影響Fig.4 Effect of subsection control of pH value on glucose(A)and xylose(B)utilization in the hydrogen production process of cotton stalk hydrolysate fermentation byE.cloacaeWL1318

由圖4可知，在發酵過程中，24 h和48 h調控pH值處理的葡萄糖質量濃度略低于未調控處理的，葡萄糖利用率略高于未調控處理的。由此可見，E.cloacaeWL1318發酵棉稈水解糖液產氫過程中調控發酵液pH值對棉稈水解糖液中葡萄糖利用的影響并不顯著（P＞0.05），僅引起了葡萄糖質量濃度及其利用率的略微變化（見圖4A）。發酵液24 h和48 h調控pH值對棉稈水解糖液中木糖利用的影響均不顯著（P＞0.05），說明在發酵24 h和48 h調控pH值并不影響棉稈水解糖液中木糖的利用（見圖4B）。

2.4 分段調控pH值對E.cloacaeWL1318發酵棉稈水解糖液產氫過程中菌株生長的影響

檢測了E.cloacaeWL1318發酵棉稈水解糖液產氫過程中的活菌數和菌體生長OD600nm的變化，結果如圖5所示。

圖5 分段調控pH值對E.cloacaeWL1318發酵棉稈水解糖液產氫過程中活菌數和OD600 nm的影響Fig.5 Effect of alternative pH regulation on viable count and OD600 nm in the hydrogen production process of cotton stalk hydrolysate fermentation byE.cloacaeWL1318

由圖5可知，分段調控pH值對E.cloacaeWL1318發酵棉稈水解糖液產氫過程中的活菌數變化影響較大，發酵24h調控pH值，其活菌數在發酵48 h達到峰值；48 h調控pH值的處理，其活菌數在發酵72 h達到另一個峰值；未調控處理，其活菌數在發酵24 h達到峰值后，數量急劇下降，至發酵結束（120 h），其活菌數已接近初始接種的活菌數量水平。相應地，從OD600nm的變化曲線來看，分段調控pH值的處理，其OD600nm在調控時間點后均顯著高于未調控處理的（P＜0.05）。可見，在一定的發酵階段進行pH值調控，有利于細菌菌體的生長，而細菌菌體的生長對于菌株發酵產氫是十分必要的。

E.cloacaeWL1318是一類典型的兼性厭氧細菌，這類細菌發酵產氫主要通過混合酸發酵途徑進行[12-13]，因此，這類細菌發酵產氫的過程會伴隨大量有機酸的產生，造成發酵液pH值的降低。發酵液pH值過低勢必引起細菌生長和生物氫合成受阻，為此，在菌株發酵產氫的一定階段進行pH值調控，可以促進細菌有效生長，從而有利于生物氫的合成。

3 結論

本研究采用分段調控pH值對E.cloacaeWL1318發酵棉稈水解糖液產氫過程進行了調控。研究發現，pH調控處理首先使得發酵液中的pH值不會急劇下降，從而不會產生過低的pH培養環境，并且能維持發酵結束的pH值維持在5.0左右。

分段調控pH值對E.cloacaeWL1318發酵棉稈水解糖液產氫過程中生物氫合成和菌體生長有顯著影響（P＜0.05）。發酵48 h后，分段調控pH值處理均能顯著提高日均產氫量和累積產氫量（P＜0.05），尤以48 h調控pH值的處理提高幅度較大。采用Gompertz模型對不同處理下的累積產氫量擬合，其相關系數R2均高于0.99，闡明了動力學模型的可行性。分段調控pH值處理的產氫潛力P均高于未調控處理的，說明在發酵的一定階段調控發酵液pH值可提高菌株的產氫潛力，有利于生物氫的合成。分段調控pH值處理使E.cloacaeWL1318在調控時間點后達到活菌數峰值，且菌體生長OD600nm在調控時間點后均高于未調控處理的，表明其對菌株的生長有正調控作用。

總的來看，E.cloacaeWL1318發酵棉稈水解糖液產氫過程中發酵液pH值會急劇降低。在其一定的發酵產氫階段進行pH值調控，可以促進細菌有效生長，從而有利于生物氫的合成，調控pH處理方式為有效調控該菌株的發酵產氫過程、提高生物氫產量提供了技術參考和理論指導，具有重要的意義。

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