朗姆酒發(fā)酵過(guò)程中微生物群落結(jié)構(gòu)及其動(dòng)態(tài)演替

張葦莉，楊慧敏，胡景輝，樊曉璐，鄒 毅，李 楠*

（1.廣西大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，廣西 南寧 530004；2.廣西大學(xué) 糖業(yè)工程研究中心，廣西 南寧 530004）

朗姆酒是以甘蔗汁或甘蔗糖蜜為原料，經(jīng)酒精發(fā)酵、蒸餾、陳釀、勾兌、過(guò)濾等一系列工序后得到的一種蒸餾型酒精飲品。其口感豐富，香醇芳郁，且有保健效果，深受人們喜愛(ài)[1-2]。朗姆酒的發(fā)酵是以酵母作為主發(fā)酵菌種，通過(guò)添加丹多液進(jìn)行共發(fā)酵，丹多液中的多種微生物及甘蔗自帶微生物發(fā)酵產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物對(duì)酒體的影響和風(fēng)味物質(zhì)的形成具有重要意義，如乳酸桿菌在朗姆酒發(fā)酵過(guò)程中為酒體添香和風(fēng)味物質(zhì)形成提供前體物質(zhì)[3-4]，因此，了解發(fā)酵過(guò)程中微生物群落多樣性的變化將有助于科學(xué)地認(rèn)識(shí)朗姆酒釀酒微生物菌群代謝，對(duì)朗姆酒品質(zhì)的提高具有重要意義[5]。傳統(tǒng)微生物群落多樣性主要通過(guò)分離培養(yǎng)技術(shù)、生物標(biāo)記法和現(xiàn)代分子生物學(xué)免培養(yǎng)等技術(shù)獲得[6-7]。進(jìn)入21世紀(jì)，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）技術(shù)開(kāi)始應(yīng)用于白酒微生物群落結(jié)構(gòu)的研究，但是該技術(shù)具有分辨率低（僅能檢出少數(shù)優(yōu)勢(shì)種群）、條帶回收困難、難以定量確定條帶比例等缺點(diǎn)[8-9]。高通量測(cè)序技術(shù)是在近年來(lái)快速發(fā)展并廣泛應(yīng)用于多學(xué)科多領(lǐng)域的微生物群落多樣性檢測(cè)技術(shù)，如土壤[10]、湖泊[11]、淤泥[12]等生態(tài)環(huán)境，香腸[13]、米酒[14]、醋[15]等發(fā)酵食品，利用高通量測(cè)序技術(shù)不需要進(jìn)行單菌落分離提取，便可直接在微生物基因水平上獲取群落資源，該方法具有通量高，效率高，測(cè)序快，覆蓋率高等優(yōu)點(diǎn)[16]，在保證測(cè)序深度和測(cè)序質(zhì)量的條件下，可獲得較為全面的微生物群落多樣性評(píng)估信息[17]。

本研究主要通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)研究朗姆酒發(fā)酵中的微生物群落結(jié)構(gòu)及其動(dòng)態(tài)變化規(guī)律，確定發(fā)酵進(jìn)程中各階段的優(yōu)勢(shì)菌種，以期為朗姆酒生產(chǎn)與質(zhì)量控制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

朗姆酒發(fā)酵液：廣西海酩威釀酒股份有限公司；土壤基因組提取試劑盒：美國(guó)MP Biomedicals公司；DNA聚合酶AP221-02、Trans DNA 15KMarker：北京全式金生物技術(shù)（TransGen Biotech）公司；產(chǎn)物回收試劑盒：天根生化科技（北京）有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

JulaboTW12恒溫水浴鍋：優(yōu)萊博技術(shù)有限公司；Nano Drop 2000紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)、ST16R高速冷凍離心機(jī)、PICO17小型臺(tái)式離心機(jī)：賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司；GeneAmpR9700型PCR儀：美國(guó)ABI公司；QuantiFluorTM-ST DNA定量?jī)x：美國(guó)Promega公司；Illumina Miseq高通量測(cè)序儀：美國(guó)Illumina公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品采集

分別取發(fā)酵第1天、2天、3天、4天、5天的朗姆酒發(fā)酵液（記為樣品A1、A2、A3、A4、A5），取樣方法為5點(diǎn)取樣法，從發(fā)酵罐（取樣深度80 cm左右）四角及中心處取樣品，在無(wú)菌條件下混合均勻后，后冷凍保存于-80℃。

1.3.2 樣品總DNA提取、PCR擴(kuò)增及檢測(cè)

將朗姆酒發(fā)酵液樣品送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司，由美吉公司采用土壤基因組提取試劑盒提取總DNA，具體操作方法按照試劑盒內(nèi)說(shuō)明書(shū)操作。先進(jìn)行細(xì)菌和真菌特異區(qū)域的PCR擴(kuò)增。16S rDNA V3-V4區(qū)的測(cè)序引物為338F（5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3'）和806R（5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）[18-19]；ITS1區(qū)的引物為ITS1F（5'-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3'）和ITS2（5'-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3'）[20]。將全部實(shí)驗(yàn)樣本進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)。用凝膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物，用Tris-HCl洗脫，并將PCR產(chǎn)物用DNA熒光定量系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)定量。1.3.3測(cè)序文庫(kù)構(gòu)建、測(cè)序與拼接

構(gòu)建Miseq文庫(kù)時(shí)，需通過(guò)PCR將Illumina官方接頭序列添加至目標(biāo)區(qū)域外端；后使用凝膠回收試劑盒切膠將PCR產(chǎn)物進(jìn)行回收；然后用Tris-HCl緩沖液來(lái)洗脫產(chǎn)物，并用2%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)；最后利用氫氧化鈉對(duì)PCR產(chǎn)物變性的原理，產(chǎn)生單鏈DNA片段。利用Illumina Miseq高通量測(cè)序儀進(jìn)行雙端測(cè)序（paired-end sequencing）。將Miseq測(cè)序得到的PE reads根據(jù)overlap關(guān)系進(jìn)行拼接，同時(shí)對(duì)序列質(zhì)量進(jìn)行質(zhì)控和過(guò)濾，得到樣品的有效序列，校正序列方向，使用FLASH和Trimmomatic軟件得到優(yōu)化序列[21]。1.3.4數(shù)據(jù)分析

將測(cè)序結(jié)果在美吉公司的I-sangerz在線(xiàn)生物信息分析平臺(tái)上進(jìn)行分析。樣品標(biāo)記區(qū)分后，采用Usearch軟件進(jìn)行操作分類(lèi)單元（operational taxonomic unit，OTU）聚類(lèi)分析。對(duì)于相似性水平≥97%的OTU進(jìn)行生物信息統(tǒng)計(jì)，其中每個(gè)OTU代表一個(gè)物種[22]?；贠TU聚類(lèi)分析和各個(gè)分類(lèi)水平下物種的比對(duì)結(jié)果，利用Qiime軟件對(duì)OTU進(jìn)行多樣性指數(shù)分析，以及對(duì)測(cè)序深度進(jìn)行檢測(cè)[23]；基于分類(lèi)學(xué)信息，在各個(gè)分類(lèi)水平上進(jìn)行群落結(jié)構(gòu)的統(tǒng)計(jì)分析。即在各個(gè)分類(lèi)水平上統(tǒng)計(jì)各樣品微生物群落組成。其中，細(xì)菌16SrDNA V3-V4區(qū)采用Sliva細(xì)菌數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)；真菌ITS1區(qū)采用Unite真菌數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)。同時(shí)采用Qiime軟件和RDP Classifier算法，選擇置信度閾值≥0.9，進(jìn)行物種注釋和豐度分析[24]。為評(píng)估微生物分類(lèi)與環(huán)境變量之間的相關(guān)性，基于分類(lèi)學(xué)信息的基礎(chǔ)上利用Qiime軟件對(duì)微生物群落和環(huán)境因子的相關(guān)性進(jìn)行Mantel text分析[25-26]。

Rank-abundance曲線(xiàn)是分析多樣性的一種方式。構(gòu)建方法是統(tǒng)計(jì)單一樣品中，每一個(gè)OTU所含的序列數(shù)，將OTUs按豐度（所含有的序列條數(shù)）由大到小等級(jí)排序，再以O(shè)TU等級(jí)為橫坐標(biāo)，以每個(gè)OTU中所含的序列數(shù)（也可用OTU中序列數(shù)的相對(duì)百分含量）為縱坐標(biāo)，使用97%相似度的OTU，利用R語(yǔ)言工具制作曲線(xiàn)圖。Rank-abundance曲線(xiàn)可用來(lái)解釋多樣性的兩個(gè)方面，即物種豐度和物種均勻度。在水平方向，物種的豐度由曲線(xiàn)的寬度來(lái)反映，物種的豐度越高，曲線(xiàn)在橫軸上的范圍越大；曲線(xiàn)平滑程度反映了樣品中物種的均勻度，曲線(xiàn)越平緩，物種分布越均勻[27]。

2 結(jié)果與分析

2.1 測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及Alpha多樣性統(tǒng)計(jì)

2.1.1細(xì)菌多樣性分析

對(duì)5個(gè)樣品的細(xì)菌群落進(jìn)行測(cè)序分析，共得到187063條有效序列，樣品的細(xì)菌群落多樣性指數(shù)見(jiàn)表1。

表1 細(xì)菌多樣性指數(shù)分析Table 1 Index analysis of bacterial diversity

Coverage指數(shù)指各樣本文庫(kù)的覆蓋率，反映測(cè)序結(jié)果是否代表了樣本中微生物的真實(shí)情況，其數(shù)值越高，表示樣本中序列被測(cè)出的概率越高；Chao指數(shù)和Ace指數(shù)用來(lái)估計(jì)樣本中物種豐富度，Chao指數(shù)越大，表示總物種種類(lèi)越多，Ace指數(shù)越大，表明樣本的真實(shí)物種種類(lèi)越多；Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)是物種均勻度和豐富度的綜合指標(biāo)，用來(lái)估算樣本中群落多樣性，Shannon指數(shù)越大，Simpson指數(shù)越小，表明群落多樣性越高。由表1可知，樣品的Coverage

指數(shù)均＞99.9%，表明測(cè)序深度已覆蓋到測(cè)試樣品中的大部分物種，可以真實(shí)展示樣品中的絕大數(shù)細(xì)菌；Chao指數(shù)和Ace指數(shù)總體上呈現(xiàn)先減小后增大的趨勢(shì)，第2天最小，表明此時(shí)發(fā)酵液中細(xì)菌物種種類(lèi)最少，第5天最大，表明此時(shí)發(fā)酵液中細(xì)菌物種種類(lèi)最豐富；Shannon指數(shù)先增大后減小，Simpson指數(shù)先減小后增大，發(fā)酵第3天時(shí)，Shannon指數(shù)最大，發(fā)酵第3天和第4天時(shí)，Simpson指數(shù)小于第1、2、5天，表明此時(shí)發(fā)酵液中細(xì)菌群落多樣性最大，第5天時(shí)，Shannon指數(shù)最小，Simpson指數(shù)最大，表明此時(shí)發(fā)酵液中細(xì)菌群落多樣性最小。

2.1.2 樣品細(xì)菌群落的Rank-abundance曲線(xiàn)

圖1 細(xì)菌群落的Rank-abundance曲線(xiàn)Fig.1 Rank-abundance curves of bacterial community

圖1 為朗姆酒發(fā)酵過(guò)程中5個(gè)階段細(xì)菌的Rank-abundance曲線(xiàn)。由圖1可知，細(xì)菌物種相對(duì)豐度：第3天＞第4天＞第2天＞第5天＞第1天；物種均勻度：第3天＞第4天＞第2天＞第1天＞第5天，第1天的細(xì)菌相對(duì)豐度最小，表明此時(shí)細(xì)菌物種種類(lèi)最少，第5天均勻度最小，表明此時(shí)發(fā)酵液中各物種所占比例差異較大，第3天的朗姆酒發(fā)酵液中物種豐富度和均勻度均最大，表明此時(shí)發(fā)酵液中細(xì)菌種類(lèi)最多，且各物種所占比例相似，群落多樣性最大。

結(jié)合表1和圖1可知，第1天開(kāi)始，細(xì)菌群落多樣性增加，這是因?yàn)槠鹗茧A段細(xì)菌大多來(lái)源于甘蔗表皮帶入的天然微生物，這些細(xì)菌在適應(yīng)新生境過(guò)程中，出現(xiàn)了種類(lèi)和構(gòu)成的急劇變化，第3天，丹多液的添加帶來(lái)了大量的細(xì)菌，使得此時(shí)發(fā)酵液中細(xì)菌物種最豐富，群落多樣性最大。2.1.3真菌的多樣性指數(shù)分析

對(duì)5個(gè)樣品的真菌群落進(jìn)行測(cè)序分析，共得到168185條有效序列，樣品的真菌群落多樣性指數(shù)見(jiàn)表2。

由表2可知，樣品的Coverage指數(shù)均＞99.9%，可以真實(shí)展示樣品中的絕大多數(shù)真菌；第1天時(shí)，Ace指數(shù)和Chao指數(shù)最大，表明此時(shí)真菌的物種種類(lèi)最為豐富；第2天稍有減少，第3、4、5天，Ace指數(shù)和Chao指數(shù)出現(xiàn)了較大幅度的降低，表明此階段真菌種類(lèi)大幅減少，這可能是由于發(fā)酵液中微生物產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物改變了發(fā)酵液的理化特性，不適宜真菌的生長(zhǎng)，從而降低了真菌的多樣性；第5天Ace指數(shù)和Chao指數(shù)最小，此時(shí)發(fā)酵液中真菌種類(lèi)最少；第2天，Shannon指數(shù)最大，Simpson指數(shù)最小，說(shuō)明此時(shí)發(fā)酵液中真菌群落多樣性最大，第3、4、5天，Shannon指數(shù)大幅度降低，Simpson指數(shù)大幅度增加，表明此階段真菌群落多樣性大幅減少。

表2 在97%相似水平下真菌多樣性指數(shù)分析Table 2 Index analysis of fungal diversity at 97%similar level

2.1.4 真菌的Rank-abundance曲線(xiàn)

圖2 真菌群落的Rank-abundance曲線(xiàn)Fig.2 Rank-abundance curves of fungal community

圖2 為朗姆酒發(fā)酵過(guò)程中5個(gè)階段真菌的Rank-abundance曲線(xiàn)，由圖2可知，真菌物種相對(duì)豐度：第1天＞第2天＞第4天＞第3天＞第5天，物種均勻度：第2天＞第1天＞第4天＞第5天＞第3天，結(jié)合表2和圖2可知，第1天真菌種類(lèi)最多，但此時(shí)的群落多樣性不是最大，這是由于各真菌物種所占比例差異較大，物種均勻度小，第2天真菌種類(lèi)相較第1天有所減少，但此時(shí)的群落多樣性最大，這是因?yàn)榇藭r(shí)物種均勻度大，各真菌物種所占比例相似，第3天以后真菌物種豐富度和均勻度大幅降低。

結(jié)合細(xì)菌多樣性和真菌多樣性結(jié)果可知，細(xì)菌的Chao指數(shù)和Shannon指數(shù)均大于真菌，表明在朗姆酒發(fā)酵過(guò)程中細(xì)菌種類(lèi)和群落多樣性始終大于真菌。

2.2 朗姆酒發(fā)酵期間菌群群落結(jié)構(gòu)變化分析

2.2.1 朗姆酒發(fā)酵期間細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)變化分析

采用RDP classifier對(duì)各樣品中的OTU進(jìn)行細(xì)菌門(mén)和屬水平分析，獲得7個(gè)門(mén)，包括放線(xiàn)菌門(mén)（Actinobacteria）、梭桿菌門(mén)（Fusobacteria）、擬桿菌門(mén)（Bacteroidetes）、變形菌門(mén)（Proteobacteria）、厚壁菌門(mén)（Firmicutes）、藍(lán)細(xì)菌門(mén)（Cyanobacteria）和其他（others）相對(duì)豐度較小的門(mén)細(xì)菌；17個(gè)屬，包括乳酸桿菌屬（Lactobacillus）、酵單胞菌屬（Zymomonas）、明串珠菌屬（Leuconostoc）、泛菌屬（Pantoea）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、普雷沃菌屬（Prevotella）等。

圖3 門(mén)水平上細(xì)菌樣本群落組成分析Fig.3 Composition analysis of bacterial community at the phylum level

門(mén)水平上的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)如圖3所示。由圖3可知，發(fā)酵第1、2、3天朗姆酒發(fā)酵液中優(yōu)勢(shì)菌門(mén)為藍(lán)細(xì)菌門(mén)（Cyanobacteria），次優(yōu)勢(shì)菌門(mén)為厚壁菌門(mén)（Firmicutes）、變形菌門(mén)（Proteobacteria），隨著發(fā)酵的進(jìn)行藍(lán)細(xì)菌門(mén)（Cyanobacteria）的細(xì)菌比例逐漸減少，厚壁菌門(mén)（Firmicutes）的細(xì)菌比例逐漸增多，第4天開(kāi)始，厚壁菌門(mén)（Firmicutes）繼續(xù)增加迅速成為優(yōu)勢(shì)細(xì)菌，到發(fā)酵第5天比例達(dá)到最大值，在發(fā)酵液中比例為96.93%。

圖4 屬水平上細(xì)菌樣本的群落組成分析Fig.4 Composition analysis of bacterial community at the genus level

屬水平上的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)如圖4所示。由圖4可知，發(fā)酵第1、2、3天，朗姆酒發(fā)酵液中的優(yōu)勢(shì)菌屬為未分類(lèi)的藍(lán)細(xì)菌屬（unclassified-Cyanobacteria），其次為乳酸桿菌屬（Lactobacillus）、酵單胞菌屬（Zymomonas）、明串珠菌屬（Leuconostoc）、泛菌屬（Pantoea）等。第1天，藍(lán)細(xì)菌屬在發(fā)酵液中所占比例最大，這可能是因?yàn)樗{(lán)細(xì)菌能較快的適應(yīng)新環(huán)境，隨后其比例開(kāi)始逐步減小，但仍處于優(yōu)勢(shì)地位，而乳酸桿菌屬所占比例從第1天開(kāi)始逐步增加，第4天乳酸桿菌屬取代藍(lán)細(xì)菌屬成為發(fā)酵液中優(yōu)勢(shì)菌屬，且在發(fā)酵第5天所占比例達(dá)到最大值96.51%，這一現(xiàn)象現(xiàn)在瀘型酒發(fā)酵過(guò)程中也同樣存在，栗連會(huì)[28]的研究中，對(duì)瀘型酒酒醅中乳酸菌群落進(jìn)行功能預(yù)測(cè)并模擬發(fā)酵驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)乳酸菌在碳水化合物代謝中參與最多的是糖酵解途徑，還具有合成丁酸、丙酸代謝的潛力。張艷[29]的研究也發(fā)現(xiàn)，通過(guò)乳酸菌與酵母的相互作用，乳酸菌可通過(guò)影響酵母菌的生長(zhǎng)和代謝來(lái)調(diào)節(jié)釀造微生物區(qū)系的平衡和白酒呈味物質(zhì)的產(chǎn)生，對(duì)醬香基酒的品質(zhì)產(chǎn)生一定影響。結(jié)合朗姆酒生產(chǎn)工藝，朗姆酒在發(fā)酵過(guò)程中，乳酸桿菌屬（Lactobacillus）通過(guò)發(fā)酵產(chǎn)生乳酸，并與酒精反應(yīng)生成乳酸乙酯，乳酸乙酯與酵母菌發(fā)酵得到乙酸乙酯混合，這對(duì)朗姆酒特殊風(fēng)味的形成具有重要意義。

2.2.2 朗姆酒發(fā)酵期間真菌群落結(jié)構(gòu)變化分析

采用RDPclassifier對(duì)各樣品中的OTU依次進(jìn)行真菌門(mén)和屬水平的信息分析，共獲得4個(gè)門(mén)，包括子囊菌門(mén)（Ascomycota）、擔(dān)子菌門(mén)（Basidiomycota）和未分類(lèi)真菌（unclassi fied Fungi）和其他門(mén)真菌；11個(gè)屬，主要有未分類(lèi)的酵母菌屬（unclassifiedSaccharomyces）、枝氯霉屬（Ramichloridium）、隱球菌屬（Cryptococcus）、鐮刀霉屬（Fusarium）、間座殼屬（Diaporthe）等。

樣品在門(mén)水平上的真菌群落結(jié)構(gòu)如圖5所示，由圖5可知，子囊菌門(mén)（Ascomycota）在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中始終處于優(yōu)勢(shì)地位，第1天，其在發(fā)酵液中所占比例最小為99.47%，隨后一直增加，第3天比例達(dá)到100%，第1、2天發(fā)酵液中有少量的擔(dān)子菌門(mén)（Basidiomycota）一些未分類(lèi)真菌以及其他門(mén)真菌，第3天以后，整個(gè)發(fā)酵液中全部為子囊菌門(mén)真菌。

圖5 門(mén)水平上真菌樣本的群落組成分析Fig.5 Composition analysis of fungal community at the phylum level

樣品在屬水平的真菌群落組成如圖6所示，由圖6可知，第1天，發(fā)酵液中的優(yōu)勢(shì)真菌為酵母屬，其所占比例＞90%，其次為枝氯霉屬（Ramichloridium）、隱球菌屬（Cryptococcus）、鐮刀霉屬（Fusarium）、間座殼屬（Diaporthe），隨后酵母屬在發(fā)酵液中的比例逐步增加，并一直處于優(yōu)勢(shì)地位，第5天比例最高，為99.77%，而其他真菌屬比例逐步減小，第3天以后發(fā)酵液中只剩少量的鐮刀霉屬（Fusarium）、隱球菌屬（Cryptococcus）和大量的酵母屬（Saccharomyces）。

圖6 屬水平上真菌樣本的群落組成分析Fig.6 Composition analysis of fungal community at the genus level

2.3 樣品的Beta多樣性分析

2.3.1 細(xì)菌屬水平的PCA主成分分析

對(duì)發(fā)酵過(guò)程中5個(gè)樣本的細(xì)菌進(jìn)行屬水平上的主成分分析（principal component analysis，PCA）分析，結(jié)果如圖7所示。由圖7可知，發(fā)酵第1天和第2天樣品的距離較近，第4天和第5天樣品的距離較近，表明這兩個(gè)階段細(xì)菌屬組成相似度高，第3天和第5天距離最遠(yuǎn)，表明這一階段細(xì)菌屬多樣性大，這是因?yàn)樘砑拥ざ嘁簬?lái)了大量的細(xì)菌，使得此時(shí)發(fā)酵液中細(xì)菌物種和種類(lèi)極為豐富，組成最為復(fù)雜。

圖7 屬水平上細(xì)菌樣本的PCA分析Fig.7 Principal component analysis of bacteria samples at the genus level

2.3.2 真菌屬水平的PCA主成分分析

對(duì)發(fā)酵過(guò)程中5個(gè)樣本的真菌進(jìn)行屬水平上的PCA分析，如圖8所示。由圖8可知，第1、2、3天樣品間距離遠(yuǎn)且分散，表明此階段發(fā)酵液中真菌組成相似度低，群落多樣性大，第3、4、5天樣品距離近且集中，表明此階段發(fā)酵液中真菌組成相似度高，群落多樣性小。這是因?yàn)榈?天后發(fā)酵液中其他屬的真菌逐漸消失，發(fā)酵液中主要真菌為酵母屬。

圖8 屬水平上真菌樣本的PCA分析Fig.8 Principal component analysis of fungal samples at the genus level

2.4 樣品的環(huán)境因子分析

2.4.1 OUT水平上細(xì)菌的Mantel test分析

為得到樣品細(xì)菌群落與環(huán)境因子相關(guān)性，利用Qiime軟件對(duì)細(xì)菌群落和各環(huán)境因子進(jìn)行OUT水平上的Mantel text分析，結(jié)果如表3所示。

表3 OUT水平上細(xì)菌的Mantel test分析Table 3 Mantel test analysis of bacteria at the OUT level

Mantel text可用來(lái)分析微生物群落與環(huán)境因子的相關(guān)性，R值越接近1，表明微生物群落與環(huán)境因子越正相關(guān)，越接近-1表明兩者越負(fù)相關(guān)，0表示兩者不相關(guān)。

由表3可知，以O(shè)UT為分類(lèi)水平，在置換檢驗(yàn)次數(shù)為999次的情況下，pH值與細(xì)菌群落多樣性呈正相關(guān)，糖含量、糖含量和pH與細(xì)菌群落多樣性呈負(fù)相關(guān)，且pH值（P＞0.05）、糖含量、糖含量和pH值對(duì)細(xì)菌群落多樣性影響均不顯著，但三種環(huán)境因子中，pH值對(duì)細(xì)菌群落多樣性的顯著性水平最高，因此是影響細(xì)菌群落多樣性的主要因素。

2.4.2 OUT水平上真菌的Mantel test分析

為得到樣品真菌群落與環(huán)境因子相關(guān)性，利用Qiime軟件對(duì)真菌群落和各環(huán)境因子進(jìn)行OUT水平上的Manteltext，結(jié)果如表4所示。

表4 OTU水平上真菌的Mantel test分析Table 4 Mantel test analysis of fungal at the OUT level

由表4可知，以O(shè)UT為分類(lèi)水平，在置換檢驗(yàn)次數(shù)為999次的情況下，pH值與真菌群落多樣性呈正相關(guān)，且pH值對(duì)真菌群落多樣性有顯著的影響（P＜0.05），糖含量、糖含量和pH值對(duì)真菌群落多樣性影響均不顯著（P＞0.05）。

3 結(jié)論

本研究采用高通量測(cè)序方法系統(tǒng)鑒定了朗姆酒發(fā)酵過(guò)程中細(xì)菌和真菌微生物菌群多樣性，共鑒定得到到53個(gè)細(xì)菌菌屬和25個(gè)真菌菌屬。高通量測(cè)序結(jié)果表明，朗姆酒發(fā)酵液中細(xì)菌群落多樣性始終大于真菌，且細(xì)菌群落多樣性在第3天添加丹多液后達(dá)到最大，此階段中主要優(yōu)勢(shì)細(xì)菌為未分類(lèi)的藍(lán)細(xì)菌屬（unclassified-Cyanobacteria），第5天的群落多樣性最小，此階段主要優(yōu)勢(shì)細(xì)菌為厚壁菌門(mén)的乳酸桿菌屬（Lactobacillus）；真菌群落多樣性在第2天最大，第3天后真菌群落多樣性一直減小，且其物種組成相似度高，整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中，酵母菌始終屬于優(yōu)勢(shì)真菌。通過(guò)Manteltext分析微生物群落與環(huán)境因子間的相關(guān)性，結(jié)果顯示，在OUT水平上，三種環(huán)境因子中，影響細(xì)菌群落多樣性和真菌群落多樣性的主要是pH值，且真菌群落多樣性與pH值之間具有顯著正相關(guān)（P＜0.05）。

本試驗(yàn)為研究微生物對(duì)朗姆酒風(fēng)味物質(zhì)的形成提供理論依據(jù)，對(duì)后續(xù)優(yōu)勢(shì)功能菌的分離篩選以及人工接種風(fēng)味菌以提高朗姆酒質(zhì)量奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

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