放線菌產殺蟲物質的初步鑒別及其活性評價

張遵霞 張亞妮 方偉 張志剛 王開梅 萬中義

摘要：從中國四川樂山地區采集的土樣中分離到1株放線菌HBERC-21542，農藥活性測定發現其發酵粗提物對農業害蟲具有很好的殺蟲活性。對HPLC半制備組分進行農藥活性測定結果表明，其殺蟲活性成分出峰時間在14～19 min。根據HPLC-MS圖譜特征確定了活性物質的分子離子峰及分子量，結合UV吸收光譜及文獻數據，初步確定其為聚醚化合物費棱西霉素A。對發酵提取物進行HPLC制備后，獲得了純度在90%左右的純品，在50 μg/mL濃度下，其對小菜蛾、棉鈴蟲的殺蟲效果達到90%～100%。

關鍵詞：天然產物；殺蟲活性；放線菌；費棱西霉素A

中圖分類號：S476 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2018）07-0061-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.07.014

Identification and Evaluation of a Natural Product with Insectcidal Activity Produced by an Actinomycetes Strain

ZHANG ZUN-xia， ZHANG Ya-ni， FANG Wei， ZHANG Zhi-gang， WANG Kai-mei， WAN Zhong-yi

（Hubei Biopesticide Engineering Research Center/The Branch Center of Biopesticide， Hubei Agricultural Sciences and Technology Innovation Center， Wuhan 430064， China）

Abstract： During the screening process of natural products produced by actionmycetes，a strain HBERC-21542 was isolated from soil samples collected in Leshan district，Sichuan province. The fermentation extract exhibited strong insectcidal activities against some insects such as Plutella xylostell，Helicoverpa armigera，etc. It was determined by components bioassay that the active compounds were in between 14～19 min in HPLC profile，and the active compound was identified as Ferensimycin A based on MS，UV absoption spectrum and natural product dictionary. Pure compound of 90% was obtained by preparative HPLC，and the lethal rate was 90%～100% at 50 μg/mL against Plutella xylostell，Helicoverpa armigera.

Key words： natural products；insectcidal activity；actinomycetes；Ferensimycin A

在生物源農藥的研究及開發工作中，放線菌產生的活性天然產物是其重要來源。在國內市場上，農用抗生素占生物源農藥市場份額的90%左右[1]。天然產物的重要性在于，一方面，它們可經過發酵、提取及劑型化等后處理過程制成生物農藥，如現在廣泛使用的生物農藥阿維菌素、多殺菌素、井岡霉素、農抗120等[2]；另一方面，以天然產物為模板，對其結構進行優化改造，是研發高效、低毒、綠色農藥的另一途徑，如阿米西達，就是以真菌產生的Strobilurin[3]為先導化合物經人工改造而獲得的。

HBERC-21542是湖北省生物農藥工程研究中心在農藥活性天然產物篩選過程中，從四川樂山地區采集的土樣中分離到的1株放線菌，其發酵提取物經室內生物測定，對多種農作物害蟲靶標具有良好的殺蟲活性，對發酵提取物進行HPLC半制備及自動收集，獲得了不同時間流出的樣品共36份，經生物測定，確定其活性成分在14～19 min。對提取物的HPLC-MS圖譜分析后，確定了目標產物的紫外吸收波長及分子量，結合天然產物數據庫比對，初步鑒定出活性產物的化學結構，并采用純品進行了室內活性評價，以期為生物源農藥的開發提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 放線菌HBERC-21542，分離自四川樂山地區采集的山地渣土，由湖北省生物農藥工程研究中心分離保藏。

農藥活性測定用蟲：小菜蛾（Plutella xylostell）、棉鈴蟲（Helicoverpa armigera）、蚜蟲（Aphis craccivora）。農藥活性測定用草：浮萍（Lemna minor）、油菜（Brassica campestris）、狗芽根[Cynodon dactylon（Lynn.）]。

1.1.2 培養基

1）斜面培養基：ISP-2培養基。采用18 mm×180 mm玻璃試管，每管裝瓊脂培養基8～10 mL。

2）種子培養基：同ISP-2，不加瓊脂，另加入2～4滴豆油作消泡劑。采用500 mL帶擋板三角瓶，每瓶裝培養基100 mL，121 ℃滅菌30 min。

3）發酵培養基：主要成分為葡萄糖、棉子蛋白、酵母浸粉等。采用500 mL帶擋板三角瓶，每瓶裝培養基100 mL，121 ℃滅菌30 min。

1.1.3 主要設備及軟件、數據庫 LYO-0.8型冰凍干燥機（上海東富龍科技有限公司生產）；Büchi Evaprator R-200型旋轉蒸發儀、Waters高效制備液相色譜儀（Waters 2525泵，帶2767自動收集系統，2996二極管陣列式檢測器）、Waters 2695高效液相色譜儀（Waters 2996二極管陣列式檢測器）、Micromass Quattro micro ？誖質譜儀（電噴霧離子源ESI、正負離子模式）；Masslynx V 4.1液質聯用分析軟件，查普曼（Chapman）天然產物數據庫2003版。

1.1.4 主要化學試劑 乙腈、甲醇、乙酸，色譜純（天津基準化學試劑有限公司）；乙酸乙酯（西隴化工股份有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 搖瓶發酵 在嚴格無菌條件下，從瓊脂斜面取8～10 mm2的一塊菌苔轉移至種子搖瓶中，置旋轉式搖床上28 ℃，150 r/min，振蕩培養72～96 h，然后按10%（V/V）的接種量轉接至發酵培養基中，在旋轉式搖床上，28 ℃，150 r/min振蕩培養100～120 h，即完成發酵。

1.2.2 發酵液的凍干及提取 將發酵液轉移至不銹鋼凍干杯中，置凍干機中冰凍干燥，凍干條件為 -40 ℃預凍2 h，冷阱預冷至-45 ℃以下，開啟真空泵升華。真空度為10～30 Pa，升溫速率為2～3 ℃/h，極限溫度升為37 ℃。取出凍干粉后，小心轉移至三角瓶中，先用少量50%（V/V）甲醇-水濕潤，再加入100 mL乙酸乙酯，于搖床上180 r/min振蕩萃取1 h，分離出酯相，旋蒸，除去溶劑，再以少量甲醇溶解后，送HPLC-MS分析。

1.2.3 生物活性測定 取1份發酵提取物，加入100 μL乙醇溶解，再加入900 μL去離子水，定容至1 mL。小菜蛾及棉鈴蟲采用24孔板進行農藥活性測定，方法為涂布法。蚜蟲農藥活性測定采用浸葉法。組分農藥活性測定采用相同的農藥活性測定靶標及方法。

1.2.4 提取物的液質聯用分析及制備 分析色譜柱為美國Sunfire C18柱，150 mm×2.1 mm（i.d），粒徑3.5 μm，柱溫40 ℃，進樣量為2 μL，流動相為去離子水和色譜純乙腈，梯度洗脫。半制備色譜柱為美國Sunfire OBD C18柱，250 mm×19 mm，粒徑為10 μm，柱溫為室溫，進樣量為800 μL，流動相為去離子水、乙腈，另加少量乙酸。質譜檢測條件：電噴霧電離（ESI），毛細管電壓為3.5 kV，錐孔電壓為70 V，離子源溫度為100 ℃，干燥氣溫度為300 ℃，脫溶劑氣體流速為500 L/h，錐孔氣體流速為50 L/h。

1.2.5 提取物的初步鑒別 根據半制備組分農藥活性測定結果，確定活性成分的出峰時間，從HPLC圖譜中，取得活性物質的紫外吸收光譜，從而確定吸收峰的波長。從ESI圖譜中可判定目標產物的分子離子峰。將吸收峰波長及分子量輸入Chapman天然產物數據庫，可查詢同該物質性質相同或相近的化合物名稱及其化學結構，并有理化及生物學性質作比對，從而確定活性化合物的種類及其化學結構。

1.2.6 化合物純品的制備 采用制備型 HPLC，每次進樣量800 μL，流動相為乙腈和去離子水，加入少量乙酸，梯度洗脫，采用自動收集器收集目標組分，合并后用氮吹儀吹干。化合物純度測定采用HPLC-MS分析。

1.2.7 化合物純品的殺蟲活性評價 稱取純度在90%以上的化合物純品1 mg，加入100 μL乙醇溶解，其濃度為10 mg/mL，再以純水稀釋至1 000、333、100、50 μg/mL，采用涂布法進行農藥活性測定，3次重復。

2 結果與分析

2.1 HBERC-21542粗提取物農藥活性

由表1可知，在A、B培養基上，發酵提取物均有殺蟲活性，但A培養基發酵提取物活性略差，這是由于在A培養基發酵條件下，該化合物很少或不產生的緣故。

2.2 HBERC-21542提取物組分農藥活性測定

從表2中可以看出，具有殺蟲活性的組分出現在14～19 min，其余組分無活性。因此，判定活性峰應在15 min前后。

2.3 HBERC-21542提取物的HPLC-MS及紫外吸收光譜

由圖1可知，10.63 min的峰為培養基雜峰，14.00 min為另一化合物的紫外吸收峰，活性化合物出現在15.17 min，而其正負離子流出現在15.26 min。

從圖2可以看出，保留時間為15.17 min的化合物紫外吸收峰在195 nm，屬末端吸收，可以認為此化合物在紫外區沒有明顯的吸收。

2.4 HBERC-21542活性產物的質譜圖

從質譜圖（圖3）中可以看出，在正負離子流模式中，質量為627及629的兩個質譜峰符合分子離子峰的特征，即其質荷比分別為M+1及M-1，次高峰687符合M-1+CH3COOH（627+60=687）的特點。在高質荷比區，分別有1 255及1 257質量數的離子出現，其豐度較低，可以判定其為二聚體。根據質譜圖的上述特征，可以確定該化合物的分子量約為628 D。

2.5 活性化合物的初步鑒定

將化合物分子量及紫外吸收峰波長輸入Chapman化合物數據庫查詢，條件為分子量介于627至629，紫外吸收峰值波長λ=0（0表示無紫外吸收峰即末端吸收）。查詢得到兩個化合物Feresinmycin A[4，5]和lysocellin[6]，這兩種化合物實際上是同一化合物的不同名稱。因此，HBERC-21542的主要活性物質為費棱西霉素A。該化合物分子式為C34H60O10，分子量為628.842，結構式如圖4所示。

2.6 活性物質純品的殺蟲活性評價

由表3可知，從室內農藥活性測定結果來看，該化合物對小菜蛾和棉鈴蟲均有很強的殺蟲活性。

3 討論

在農藥活性放線菌資源的篩選過程中，湖北省生物農藥工程研究中心發現許多具有殺蟲及抗真菌活性的天然產物，如尼日利亞菌素、獵神霉素等，它們均具有聚醚類結構。聚醚類抗生素對動物球蟲類具有很強的殺蟲活性，如莫能菌素等，常用作飼料添加劑，很少見到聚醚類抗生素作為農藥使用的報道，惟一報道的是南昌霉素[7]，它對很多農業害蟲具有明顯的防治效果。

結果表明，聚醚類抗生素對農業害蟲具有較好的殺蟲活性，另有試驗結果證實，此類抗生素也具有相當廣譜的抗真菌活性，因此，聚醚類抗生素具有開發成為農用抗生素的潛力。

參考文獻：

[1] 邱德文.我國生物農藥現狀分析與發展趨勢[J].植物保護，2007（5）：27-32.

[2] 朱昌雄，宋 淵.我國農用抗生素的現狀與發展趨勢探討[J].農藥市場信息，2007（4）：17-18.

[3] ANKE T，OBERWINKLER F，STEGLICH W，et al. The strobilurins——New antifungal antibiotics from the basidiomycete Strobilurus tenacellus[J].J Antibiot （Tokyo），1977，30（10）：806-810.

[4] KUSAKABE Y，MIZUNO T，KAWABATA S，et al. Ferensimycins A and B. two polyether antibiotics. Taxonomy，fermentation，isolation，characterization and structural studies[J].J Antibiot（Tokyo），1982，35（9）：1119-1129.

[5] WESTLEY J W，LIU C M，BLOUNT J F，et al. Isolation and characterization of four polyether antibiotics，X-14889A，B，C，and D，closely related to lysocellin and the ferensimycins[J].J Antibiot（Tokyo），1993，46（2）：280-286.

[6] EBATA E，KASAHARA H，SEKINE K，et al. Lysocellin，a new polyether antibiotic.I. Isolation，purification，physico-chemical and biological properties[J].J Antibiot（Tokyo），1975，28（2）：118-121.

[7] 歐陽諒，涂國全，高勇生，等.南昌鏈霉菌新種及其產生的兩種殺蟲抗生素[J].江西農業大學學報，1993（S4）：148-153.