熒光法測石榴中維生素C

王軍鋒，李思佳，王曉蘭

(陜西學前師范學院 化學與化工系，陜西 西安 710100)

石榴，營養豐富，其籽粒味道甘美，且石榴含有豐富的維生素C。維生素C，又稱L-抗壞血酸，是人體必需營養素之一，缺乏維生素C會致使壞血病，因此，必須從食物中獲取。目前測量維生素C的方法主要有高效液相色譜法[1]；紫外分光光度法；碘量法；熒光法[2]；電化學法[3]，滴定法、酶法；以及2、4-二硝基苯肼法等，除此之外Deutsch和Weeks曾經報道過一種檢測維生素C的熒光分析法(OPDA)，并被指定為維生素C的經典熒光分析法[4]。在該方法中，維生素C先被活性炭(Norit)氧化為脫氫抗壞血酸(DHAA)，DHAA再與熒光底物鄰苯二胺(OPDA)結合生成熒光產物，通過對該熒光產物的檢測實現對維生素C的定量分析[5]。本文基于維生素C在草酸作溶劑不外加增敏劑的條件下經Cu2+氧化后與鄰苯二胺反應生成一種較強的熒光物質，通過對體系熒光強度的測定進行維生素C的定量分析，其熒光強度與維生素C的濃度成正比，該方法所涉及的體系穩定性好，據此優化了熒光測定維生素C的方法。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

1.1.1 儀器

日立F-7000熒光分光光度計；上海F-960熒光分光光度計；PHS -3C精密pH計，上海雷磁儀器廠； 水浴鍋。

1.1.2 試劑

抗壞血酸(分析純)；1%草酸溶液；CuSO4溶液：0.04mg/mL；維生素C標準儲備液：1mg/mL，2～8℃避光保存；NaOH-鄰苯二甲酸氫鉀緩沖溶液；HAc-NaAc緩沖溶液；NaOH-KHPO4緩沖溶液；KH2PO4- Na2HPO4緩沖溶液；500g/L乙酸鈉溶液；0.2g/L鄰苯二胺溶液(臨用前配制)；30g/L硼酸-500g/L乙酸鈉溶液(臨用前配制)；偏磷酸-乙酸溶液；試驗用水為蒸餾水。

1.2 原理

維生素C自身沒有熒光，樣品中還原性抗壞血酸(維生素C)在草酸溶液后溶解后經氧化劑(Cu2+)氧化為脫氫抗壞血酸(DHAA)，再與鄰苯二胺(OPDA)反應產生具有熒光的喹喔啉，其熒光強度與維生素C的濃度在一定范圍內呈線性關系。因果蔬中丙酮酸也可與鄰苯二胺反應生成熒光化合物，加入硼酸后脫氫抗壞血酸與硼酸可構成絡合物而不能跟鄰苯二胺反應，而丙酮酸依然可以和鄰苯二胺反應，所以用加入硼酸后測出的熒光強度為空白對照，以此除清樣品中雜質所造成的干擾。

1.3 實驗方法及過程

在25mL容量瓶中依次加入1mL的維生素C標準溶，4mL CuSO4溶液，4mL緩沖溶液，氧化五分鐘后加入3mL鄰苯二胺溶液用蒸餾水定容，搖勻。在25℃恒溫水浴中加熱30min，將溶液冷卻至室溫后，在激發波長為355nm，在發射波長425nm處，測定其熒光強度F，以不含維生素C的試劑為對照組，標準系列熒光強度分別減去標準對照熒光強度為縱坐標，所對應的抗壞血酸濃度為橫坐標，繪制標準曲線。記錄直線回歸方程。

2 結果與討論

2.1 試劑加入順序

按照試驗方式，在試劑加入量無差別的情況下，查驗試劑的不同加入順序，測定其熒光強度，按照加入試劑的排列順序不同，選擇熒光強度最好最不變的一項為最佳加入試劑順序。測得當λn=415，Y=2,sens=2各試劑用量均為1mL，在25mL容量瓶中依次加入維生素C標準溶，CuSO4溶液，NaOH-鄰苯二甲酸氫鉀緩沖溶液，鄰苯二胺溶液時體系的熒光強度最大。

2.2 氧化劑濃度及用量的選擇

維生素C極易被氧化，因此，氧化劑Cu2+濃度對實驗的影響很大。圖1中為Cu2+濃度為0.00、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.12、0.14、0.16、0.20mg/mL范圍內轉變時對系統熒光強度的影響，由圖知當Cu2+濃度小于0.04時體系的熒光強度呈上升趨勢，說明仍在繼續氧化，而在Cu2+濃度大于0.04時，體系的熒光強度呈降落去向，Cu2+濃度為0.04時系統的熒光強度最大，是以選定該濃度為最好氧化劑濃度。

圖1 氧化劑濃度對體系熒光強度的影響

2.3 pH值與緩沖溶液的影響

緩沖溶液不同對系統的熒光強度影響有顯著差異，實驗如下pH值=6.0的緩沖溶液：NaOH-鄰苯二甲酸氫鉀緩沖溶液、HAc - NaAc緩沖溶、NaOH - KHPO4緩沖溶液、KH2PO4- Na2HPO4緩沖溶液，在其他試劑加入量無差別的情況下，各加入1mL上述緩沖溶液，結果表明緩沖溶液選擇NaOH-鄰苯二甲酸氫鉀時該系統的熒光強度最大。

溶液的pH值對系統的熒光強度影響很大，配制pH值=5.0～6.0的NaOH-鄰苯二甲酸氫鉀緩沖溶液，當pH值=5.6且用量為4mL時熒光強度到達最大值且比較穩定。

2.4 加熱溫度和加熱時間對熒光強度的影響

室溫下一般的氧化反應大多數是慢反應，而溫度對體系熒光強度也有較大影響，在他試劑加入量相同的條件下，設置不同的加熱溫度(20℃、25℃、30℃、35℃、40℃)測定熒光強度，再設置不同的加熱時間(10min、20min、30min、40min、50min)測定熒光強度，根據實驗所得數據選擇最佳加熱溫度和加熱時間。當水浴溫度為25℃時恒溫30min時系統的熒光強度呈現最大值。

2.5 氧化時間對熒光強度的影響

實驗中測定了不同氧化時間和不同反應時間下的熒光值，結果顯示，當t≥10min時，氧化劑氧化基本完成而且趨于穩定，因此選定氧化時間為10min進行氧化。將體系放置不同的時間進行梯度實驗，在相同的實驗條件下，每隔10min測量一次，做10組，分別測量其熒光強度，結論：體系熒光強度在20min左右可達到最大值，為了使反應徹底完全，因此選定放置時間為25min。

2.6 鄰苯二胺濃度對熒光強度的影響

鄰苯二胺的濃度是實驗中的重要條件，在其他前提條件穩定的情況下，對鄰苯二胺的濃度設置梯度(采用0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30g/L)，在此條件下逐個測定系統熒光強度，由圖2可知，當鄰苯二胺濃度>0.15g/L時，系統的熒光強度趨于穩定，為了使DHAA徹底反應，選擇0.2g/L為最好鄰苯二胺濃度。

圖2 鄰苯二胺濃度對體系熒光強度的影響

2.7 穩定性實驗

在放置時間為20min左右時測定其穩定值，每隔10min一次，測20組，得出結論：系統熒光強度可不變10min，見圖3。

圖3 反應時間對體系熒光強度的影響

2.8 激發和發射波長的選擇

對維生素C 標準溶液和空白試劑溶液按上述方法反應后的熒光物,分別在290～330nm，350～500nm內掃描得到激發和發射光譜，如圖4所示，由圖4中可以看出。在激發波長為355nm，發射波長為426nm時，系統處于最好熒光強度，空白試劑的熒光值比較穩定，則選擇激發波長為355nm，發射波長為426nm。

圖4 激發波長和發射波長

2.9 標準曲線的繪制

圖5為抗壞血酸濃度和其相對熒光強度之間的曲線圖。

圖5 工作曲線

從圖5中可以看出維生素C在濃度為0.002～4μg/mL的范圍內與系統的相對熒光強度值Δ F呈現杰出的線性關系，線性回歸方程為y=74.481x+8.5215，R2=0.9902。

2.10 測定樣品

將石榴樣品按上述方式測定后，測定熒光強度F，同時測定樣品空白溶液熒光強度F0,并得出實際的熒光強度ΔF=F-F0。根據維生素C 的標準曲線，得出石榴中維生素C 的含量。

3 結論

本文實驗了熒光法測定石榴中維生素C的含量的檢測方法，維生素C在0.002～4μg/mL濃度范圍內呈現良好的線性關系，檢測限較低，采用熒光法測定石榴中維生素C含量，具有簡便，快速，靈敏度高，結果準確等優點，可以滿足實際測量的需要。

測量樣品結果顯示同一顆石榴，背陰面與朝陽面向比，其熒光強度有所減弱，即朝陽面所測熒光強度較強，所以，石榴的朝陽面果實其維生素含量高。

由于所取石榴均為陜西省西安市臨潼區所產，分別取三地樣品(斜口、胡王、秦陵)，實驗所得樣品熒光強度并無太大性差異，因此，此三地的石榴維生素含量均比較豐富，可以滿足人體對維生素的需求。

[1] 李圣男，蔡大川，鄭家概，等.HPLC法測定番石榴中總維生素C的含量[J].廣州化工， 2017,45(11):136-138.

[2] 崔 香，寇雪玲.熒光分析法測定枸杞中維生素C[J].青海師范大學學報，2009(2):58-60.

[3] 彭文峰,Seddon B J,張學記,等.平行雙鉑絲微電極用于鐵氰化鉀電流滴定法測定抗壞血酸的研究[J].分析化學,1992,20(7):837-839.

[4] Li Xiaoyan,Zhang Yuanqin,Wang Le.A new highly sensitive spectrofluorim etric method for the determ ination of ascorbic acid[J].Journal of sichuan university (Natural Science Edition),2003,40(3):546-547.

[5] 孫振艷,趙中一,郭小慧,等.熒光分析法測定維生素C[J].化學分析計量，2006,15(4):18-20.