白茅根總黃酮提取工藝及其抗氧化性研究

翁 梁， 李西騰

(江蘇食品藥品職業技術學院食品學院，江蘇淮安 223003)

白茅根為禾本科植物白茅[ImperatecylindriaBeauv. var.major(Nees) C. E. Hubb.]的根莖，又稱白花茅根、茅草根、甜草根等[1]，是我國傳統的中藥材。白茅根性甘、味寒，有涼血止血、清熱利尿之功效，臨床可用于治療熱病煩渴、血淋、水腫、黃疸等癥[2-3]。近幾年的研究顯示，白茅根的主要化學成分有三萜類化合物、有機酸、多糖、黃酮類物質等[4]。藥理研究的結果表明，白茅根具有調節免疫力、抗腫瘤、抗氧化、抗菌、抗炎、降血糖、降血脂等作用[5]。

目前，國內對白茅根活性成分提取工藝的研究多集中在多糖的提取，并做了大量系統的研究[6]。還有科技工作者對白茅根的綠原酸、總酚酸和總三萜物質的提取進行了研究[7-8]，但有關白茅根中總黃酮的提取工藝及其抗氧化活性的研究尚未見報道。因此，本試驗采用乙醇溶液作為浸提劑，用水浴浸提法提取白茅根中的總黃酮，并對白茅根總黃酮體外抗氧化活性進行初步研究。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

白茅根，購自安徽省亳州市志民藥業有限公司。蘆丁，購自上海恒遠生化試劑有限公司。無水乙醇、氫氧化鈉、亞硝酸鈉、硝酸鋁、鐵氰化鉀、三氯乙酸、氯化鐵、1，1-二苯基-2-苦基肼(DPPH)、維生素C等均為分析純，2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT)為食品級，均購自江蘇省淮安國藥化學試劑有限公司。

粉碎機，購自上海隆拓儀器設備有限公司；UV765-可見分光光度計，購自上海精密科學儀器有限公司；電子精密天平，購自奧豪斯儀器(上海)有限公司；恒溫水浴鍋，購自上海喬躍電子有限公司；電熱恒溫鼓風干燥箱，購自上海精宏實驗設備有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 標準曲線的繪制 參照文獻[9]繪制標準曲線。準確稱取5 g蘆丁標準品置于20 mL容量瓶中，用60%乙醇溶液溶解并定容，分別吸取0、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.12 mL 置于10 mL比色管中，加入0.3 mL 5%亞硝酸鈉溶液，放置6 min，再加入0.3 mL 10%硝酸鋁鈉溶液，放置 6 min 后加入4.0 mL 5%氫氧化鈉溶液，加水至刻度線，搖勻，放置15 min，在510 nm處測吸光度，以蘆丁濃度(C)為橫坐標、吸光度(D)為縱坐標繪制標準曲線。得回歸方程D=0.309 6C+0.005 8，r2=0.999 1，表明在0～0.12 mg/mL范圍內，蕓香苷濃度與吸光度具有線性關系。標準曲線如圖1所示。

1.2.2 白茅根總黃酮提取方法 將白茅根于60 ℃烘干，粉碎過60目篩。準確稱取1.0 g粉末樣品，加入乙醇溶液，置于水浴鍋中提取，提取3次，合并提取液。按標準曲線繪制方法顯色后，在510 nm波長處測量樣品溶液的吸光度。

白茅根總黃酮含量的計算公式：總黃酮含量=C×N×V/M。其中，C為樣品的吸光度代入回歸方程計算得到的總黃酮濃度，mg/mL；N為樣品稀釋倍數；V為加入乙醇提取液的體積，mL；M為粉末樣品質量，g。

1.2.3 單因素試驗設計 試驗采用水浴法，用乙醇溶液作為浸提劑，按料液比1 g ∶30 mL、乙醇濃度70%、提取溫度 60 ℃、提取時間60 min的基本提取工藝，以總黃酮提取量為指標，確定其他條件不變，改變單因素的值，分別考察料液比[1 ∶10、1 ∶20、1 ∶30、1 ∶40、1 ∶50(g ∶mL)]、乙醇濃度(40%、50%、60%、70%、80%)、提取溫度(40、50、60、70、80 ℃)、提取時間(30、60、90、120、150 min)對白茅根總黃酮提取量的影響。

1.2.4 正交試驗設計 根據單因素試驗結果，選取料液比、乙醇濃度、提取溫度、提取時間等4個因素，采用L9(34)正交表進行試驗，通過對白茅根總黃酮提取量和正交試驗結果進行分析，確定最佳提取工藝。

1.2.5 抗氧化活性研究

1.2.5.1 DPPH自由基清除率的測定 將白茅根總黃酮提取液、BHT、維生素C配制成不同濃度的待測樣品液，再與0.01 mmol/L DPPH溶液混勻，室溫下反應30 min，然后在 517 nm 波長處測定其吸光度[9]。

DPPH自由基清除率計算公式：清除率=(1-D/D0)×100%。式中，D為樣品溶液的吸光度，D0為用無水乙醇代替樣品溶液作為空白對照的吸光度。

1.2.5.2 白茅根總黃酮還原能力測定 采用普魯士蘭法[10]測定白茅根總黃酮的還原力，以普魯士蘭的生成量為指標，在700 nm波長處測定其吸光度。試驗用相同濃度的BHT、維生素C作為對照品，吸光度越大表示還原能力越強。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 料液比對白茅根總黃酮提取量的影響 按乙醇濃度70%、提取溫度60 ℃、提取時間60 min，考察當料液比分別為1 ∶10、1 ∶20、1 ∶30、1 ∶40、1 ∶50(g ∶mL)時對白茅根總黃酮提取量的影響。由圖2可知，隨著料液比的變化，白茅根總黃酮提取量先升后降。當料液比為1 g ∶40 mL時，總黃酮提取量最高，達到1.622 mg/g。隨后當料液比為1 g ∶50 mL時，總黃酮提取量下降。

2.1.2 乙醇濃度對白茅根總黃酮提取量的影響 按料液比1 g ∶30 mL、提取溫度60 ℃、提取時間60 min，考察當乙醇濃度分別為40%、50%、60%、70%、80%時對白茅根總黃酮提取量的影響。由圖3可知，隨著乙醇濃度逐漸增大，白茅根總黃酮的提取量也逐漸增加，當乙醇濃度為70%時提取量達到最大值，當乙醇濃度達到80%時，總黃酮的提取量明顯下降。

2.1.3 提取溫度對白茅根總黃酮提取量的影響 按料液比1 g ∶30 mL、乙醇濃度70%、提取時間60 min，考察當提取溫度分別為40、50、60、70、80 ℃時對白茅根總黃酮提取量的影響。由圖4可知，隨著提取溫度的升高，總黃酮提取量逐漸增加。當提取溫度達到60 ℃及以上時，總黃酮提取量增加的較少且趨于平穩。

2.1.4 提取時間對白茅根總黃酮提取量的影響 按料液比1 g ∶30 mL、乙醇濃度70%、提取溫度60 ℃，考察當提取時間分別為30、60、90、120、150 min時對白茅根總黃酮提取量的影響。由圖5可知，提取時間在30～90 min內，白茅根總黃酮提取量增加的較為明顯。當提取時間達到90 min及以后時，總黃酮提取量趨于穩定，增加量較小。

2.2 正交試驗結果

由表1可知，正交試驗的極差(R)表現為A>D>C>B，說明對白茅根總黃酮提取量的影響表現為料液比>提取時間>提取溫度>乙醇濃度。白茅根總黃酮最佳提取工藝組合為A2B3C3D3，即料液比為1 g ∶40 mL、乙醇濃度為80%、提取溫度為80 ℃、提取時間為150 min。根據表2方差分析的結果可知，料液比、提取時間、提取溫度對總黃酮提取量具有顯著影響(P<0.05)。

2.3 抗氧化試驗結果

2.3.1 DPPH自由基清除率測定結果 由圖6可知，白茅根總黃酮對DPPH自由基有明顯的清除作用。在試驗的濃度范圍內，白茅根總黃酮對DPPH自由基清除作用隨著濃度的升高逐步增強，當濃度為1.50 mg/mL時，清除率達到45.17%。但白茅根總黃酮對DPPH自由基的清除率明顯低于相同濃度的維生素C，略好于相同濃度的BHT，說明白茅根總黃酮具有較好的抗氧化作用。

表1 正交試驗結果

表2 方差分析結果

注：“*”表示在0.05水平上影響顯著。

2.3.2 白茅根總黃酮還原能力測定結果 吸光度的變化反映樣品還原能力的強弱，吸光度越大，樣品的還原能力越強，還原能力越強，抗氧化性越強。由圖7可知，在試驗的濃度范圍內，白茅根總黃酮的還原能力隨著濃度的升高逐步增強，且還原力與濃度有線性關系。與相同濃度的維生素C相比，白茅根總黃酮的還原力明顯較差，但好于相同質量濃度的BHT，說明白茅根總黃酮具有較好的抗氧化性。

3 結論與討論

試驗以乙醇溶液作為浸提劑，用水浴浸提法提取白茅根總黃酮，采用分光光度法測定總黃酮含量。結果表明，最佳提取工藝條件為料液比1 g ∶40 mL、乙醇濃度80%、提取溫度80 ℃、提取時間150 min。該提取工藝穩定可靠，如若結合其他提取技術，能否進一步提高總黃酮的提取量，還須再做深入研究。

試驗測定白茅根總黃酮提取物清除DPPH自由基的能力及還原能力，并以相同濃度的BHT、維生素C作對照。結果表明，白茅根總黃酮清除DPPH自由基的能力及還原能力明顯小于相同濃度的維生素C，略高于相同濃度的BHT。說明白茅根總黃酮具有一定的抗氧化作用，但其抗氧化的具體成分還須做進一步研究。

參考文獻：

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