洋桔梗Ceremony Orcmge品種輻射誘變育種

陳淑英， 王玉英， 李葉芳， 何文俊， 宗積意， 宋 蓮， 張宇歡， 李枝林，2

(1.云南農業大學花卉研究所，云南昆明 650201； 2.生物多樣性與云南特色農業協同創新中心，云南昆明 650201)

洋桔梗(Enstomagrandiflorum)別稱草原龍膽、大花桔梗、麗缽花，是龍膽科龍膽屬1年生觀賞植物[1]，原生長于美國南部至墨西哥之間的石灰巖地帶，是遍布北美草原的野花，后引種到歐洲和日本，經園藝工作者們多年的培育、雜交改良，近10年間洋桔梗的育種與生產有了迅速的發展，尤以日本為盛，現已成為花形、花色多樣，株型妖媚多姿的鮮切花品種[2]。洋桔梗種子細小，價格昂貴，且種子萌發緩慢、幼苗生長緩慢，從播種到定植(3對葉)有2～3個月時間，其間受環境的影響很大，育苗技術要求很高，種苗供應受限制，我國洋桔梗育種工作仍處于停滯階段[3]。

輻射可以提高植物的突變率，在較短的時間內獲得更多的優良變異植株，為進一步良種選育提供材料，縮短育種時間[4]。相關報道表明，至今世界上已經有50多個國家在150多種植物上應用核誘變育種，已成功育成了1 737個品種，其中農作物比例最高，達74%，約1 275個品種[5]。我國已對40多種花卉進行核輻射育種改良，且已成功獲得60多個突變種，主要集中在菊花[6]、蘭花[7]、百合[8]、月季[9]、觀賞性海棠[10]、水仙[11]和蝴蝶蘭[12]等。有關洋桔梗物理誘變育種的研究，目前國內尚未見任何報道。因此，本試驗以洋桔梗組培苗為材料，進行不同劑量的60Coγ射線照射，探索適宜的處理劑量，為洋桔梗輻射育種提供技術依據和試驗方法基礎，以期創造出新、奇、特的洋桔梗變異類型，豐富洋桔梗種質資源。

1 材料與方法

1.1 材料

云南農業大學花卉研究所提供的洋桔梗品種Ceremony Orcmge組培苗，平均株高4 cm。

1.2 方法

2015年10月對處理材料在云南華源輻射有限公司進行60Coγ射線處理，劑量為0、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150 Gy，劑量率為1 Gy/min，急性照射后培育4個月，統計死亡數，進行形態觀察和記錄，直到損傷苗穩定為止。其中，變異指葉片變厚、扭曲、呈圓筒狀、葉色變深或黃化等形態異常現象；變異率指變異苗數與處理苗數的比值。

1.3 數據分析

應用Excel 2003整理數據，SPSS 20.0計算半致死劑量，LSD法進行多重比較。

2 結果與分析

2.1 不同劑量 60Co γ射線對洋桔梗組培苗死亡率的影響

在4個月內連續對輻射處理后的洋桔梗進行觀察，其生長和死亡統計情況見表1。

表1 不同劑量 60Co γ射線對洋桔梗組培苗死亡率的影響

注：同列數據后不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，相同字母表示差異不顯著(P>0.05)。下同。

由表1可知，不同劑量射線對洋桔梗組培苗成活率[成活率=(1-死亡株數/總株數)×100%]影響顯著。處理劑量為90、100 Gy時，成活率分別顯著低于對照組46、53百分點(P<0.05)。隨著輻射劑量的增加，影響程度變大，兩者呈正相關關系。輻射劑量越小，死亡的植株越少，成活率越高；輻射劑量越大，死亡植株越多，成活率越低。高劑量不僅增加了洋桔梗的死亡率，而且加快了植株的死亡速度，死亡首先從植株的莖尖部開始，然后葉片死亡，最后整株死亡，幼嫩的植株最先死亡。上述結果表明，輻射對幼嫩的器官組織損傷最大，成熟組織損傷較小。

2.2 洋桔梗組培苗的半致死劑量

為了達到較多變異，又不致過于損傷植株，實際應用中經常用半致死劑量(semi-lethal dose)作為衡量指標。計算半致死劑量，常用概率單位回歸法分析死亡率與輻射劑量之間的關系。通過盧紋岱SPSS軟件得到輻射效果模型為：Probit(P)=-2.00+0.019[lg(dose)]。得出洋桔梗的半致死劑量計算式lg(semi-lethaldose)=2.00/0.01，得到半致死劑量為103.63。皮爾遜擬合優度的卡方檢驗顯示，它們的顯著水平為0.978(大于0.15，SPSS默認)，由此判斷方程式滿足數據的擬合優度。

表2表明，輻射效果模型所期望觀察到的每個劑量的死亡數與實際觀察到的死亡數完全在誤差允許范圍內， 由此可以判斷輻射效果模型是可靠的。

表2 觀測與期望數頻

由輻射效果的模型在95%置信區間內求得的各死亡率的輻射劑量見表3，由此可知各輻射劑量都在上限與下限之間。

表3 因子變量95%的置信區間

從圖1可知，不同劑量的散點圖呈線性關系，說明用Log Base10的選項進行轉換是合適的。

2.3 60Co γ射線輻射處理對洋桔梗組培苗表型的影響

由圖2可知，經過輻射后，對洋桔梗植株的形態等會產生一定程度的影響，輻射劑量越大，對植株的影響程度越大，輻射劑量越小，對植株的影響程度越小。沒有經過輻射的洋桔梗苗葉色是綠色的，植株形態正常，經過輻射的植株出現了黃化，葉片變小、變厚、變黑、有斑，有的葉片像水浸狀，植株出現畸形等現象。隨著輻射劑量的增加，黃化、葉片變黑情況加重，葉色黃綠或黃白。從表型變化上看，60Coγ射線對洋桔梗組培苗的誘變效果明顯。

由表4可知，不同劑量射線對洋桔梗組培苗株高的影響差異顯著。處理劑量為90、100 Gy時株高分別顯著低出對照組47%、50%(P<0.05)。隨著處理劑量的升高，洋桔梗組培苗株高逐漸降低，可見60Coγ射線對矮化植株有明顯效果。

2.4 不同劑量的 60Co γ射線對洋桔梗組培苗變異率的影響

由表5可知，不同劑量射線對洋桔梗組培苗變異率的影響差異顯著。處理劑量為90、100 Gy時，變異率分別顯著高出對照組51%、45%(P<0.05)。隨著處理劑量的升高，洋桔梗組培苗的變異率先升高后降低。植株變異率的峰值出現在90～100 Gy，50 Gy后升高的趨勢比較明顯，100 Gy后隨劑量的升高變異率降低。由于死亡率隨劑量的升高而增加，故變異率并非隨著劑量升高而增加。但相對變異率(處理后存活苗中變異苗數與存活苗數的比值)隨著劑量的升高而升高。原因是輻射劑量越高，損傷越重，分化出來的芽體越容易發生變異。但過高劑量處理后存活的材料常因細胞嚴重損傷造成劣性突變或致死突變而掩蓋其他突變，不利于輻射育種。

表4 不同劑量射線對洋桔梗組培苗株高的影響

2.5 不同劑量的 60Co γ射線對洋桔梗組培苗增殖率的影響

由表6可知，不同劑量射線對洋桔梗組培苗增殖率的影響差異顯著。處理劑量為90、100 Gy時，增殖率分別顯著低出對照組49%、59%(P<0.05)。隨著處理劑量的升高，洋桔梗組培苗的增殖率逐漸降低。這應該是因為輻射后表面的細胞造成較嚴重的損傷，從而使其恢復生長的能力受到嚴重的破壞，分化能力也隨之下降。

表5 不同劑量射線對洋桔梗組培苗變異率的影響

表6 不同劑量射線對洋桔梗組培苗增殖率的影響

3 討論與結論

不同材料對射線的敏感性不同，對射線的敏感性大小依次為愈傷組織>試管苗>田間苗>根芽>插條>種子。組培苗含水量較高，在射線處理下會產生很多氧自由基，破壞核酸和蛋白質等生物大分子，是輻射誘變育種的理想材料。此外，輻射育種與組織培養結合可以提高變異保存率，克服扦插分離不徹底的缺點，加快變異的純合，從而縮短育種周期。王晶等研究60Coγ射線對菊花的誘變效應選用的是組培苗[13]；潘宏用蘭花組培苗進行蘭花輻射誘變育種[14]；張興等進行豐花月季60Coγ輻射育種選用材料也是月季組培苗[15]。因此，本試驗選用洋桔梗組培苗為處理材料。

輻射產生誘變有2個方面主要原因：一是輻射后引起遺傳物質的突變，如染色體的畸變、DNA分子的變異；二是RNA、蛋白質的生物合成受到抑制，生長素及酶等生理活性物質的代謝受到破壞，表現出細胞死亡、細胞突變，從而對生物產生抑制作用。劉麗強等在探討60Coγ輻射對觀賞海棠組培苗的輻射誘變效應時發現，生根和繼代組培苗的生根率、平均根長、苗高、增殖等隨著60Coγ射線劑量的增加而明顯下降[10]。高年春等用60Coγ輻射非洲菊組培苗，結果發現，經輻射處理后非洲菊的株高、生根率、黃化率與輻射劑量呈負相關[16]。本試驗發現，在0～150 Gy射線范圍內，洋桔梗組培苗死亡率隨照射射線劑量增加而增加，而增殖率與變異率呈負相關，這與前人的研究結果一致。

由于輻射誘變是隨機事件，因此對一定的靶標照射劑量越大，引起誘變的概率越大，并且電離輻射對植物的損傷和抑制作用也越大。因此有一些學者建議，其誘變成功率由植物成活率與突變率的乘積決定，對應最大概率積的劑量才是最適劑量。本次試驗中輻照劑量為90 Gy時，洋桔梗的死亡率為46%，變異率為51%，達到最高，因此90 Gy作為洋桔梗的輻射劑量更適宜。彭綠春等用60Coγ射線對4種蘭花作輻照處理，結果發現，冬鳳蘭、竹葉蘭、碧玉蘭、西藏虎頭蘭組培苗的半致死劑量分別為20.72、26.31、29.88、41.04 Gy[17]。楊靜坤等用60Coγ射線作誘變劑發現，碧玉蘭組培苗半致死劑量為28.88 Gy[18]。而本試驗發現，洋桔梗組培苗半致死劑量為103.63 Gy。彭綠春等選用的材料是蘭花原球莖[17-18]，而本試驗的輻照材料是具有根、莖、葉的組培苗，這可能與植物種類、不同組織器官對輻射敏感不同有關。

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