生長年限對七葉一枝花植株、根系、產量和皂苷含量的影響

陳鐵柱， 文飛燕， 夏燕莉， 楊玉霞， 方清茂， 張 浩， 薛 丹

(1.四川省中醫藥科學院，四川成都 610041； 2.四川大學華西藥學院，四川成都 610041)

七葉一枝花[ParispolyphyllaSmith var.chinensis(Franch.) Hara]是2015年版《中國藥典》收載的重樓藥材的2種基原植物之一[1]，別稱華重樓，屬二級瀕危物種。其根狀莖入藥，是傳統的中藏彝傣醫藥體系常用的大宗藥材，具有清熱解毒、消腫止痛、涼肝定驚之功效，為云南白藥系列產品、沈陽紅藥系列、季德勝蛇藥片等20多個國家重點保護重要的主要原料藥。其供需矛盾尖銳、市場缺口巨大，導致野生資源遭遇掠奪式采挖，致使許多未達入藥年限的藥材資源被倉促采挖，藥材質量下降。再者，七葉一枝花的人工規模化種植業尚未形成規模[2-4]，種源多來自野生混雜群體，在全國多數地區為從當地山上野生直接采挖移栽，由于野生生長年限不一，難以對栽培效果進行評價，種苗的混亂不堪更加劇了藥材質量的參差不齊。

對于多年生重樓來講，其藥材質量受品種、產地和采收年限等多種因素的影響，已有研究證實隨生長年限的增加，滇重樓地下根莖中甾體皂苷的含量呈現總體升高的趨勢[5-7]。而對七葉一枝花植株性狀、根系發育、產量及皂苷成分含量動態研究尚不清楚，因此合理的采收年限尚不能確定。四川的龍門山脈地區是七葉一枝花的主產區，筆者在該地區構建了七葉一枝花種質資源圃，進行了摸索性試驗研究。用種子繁育出大量的實生苗，已經連續進行了8年，得到了1～8年生的七葉一枝花植株和材料。本試驗研究用種子繁殖的七葉一枝花的植株、根系、產量和皂苷含量與其生長年限的關系，明確七葉一枝花生長趨勢曲線，探明皂苷類化學成分含量是否受到生長年限的影響，探索七葉一枝花最適宜的采收年限，為七葉一枝花規范化栽培的次生代謝調控與采收年限的確定提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥材來源 在四川省彭州市七葉一枝花種植基地于2007—2014年連續8年進行七葉一枝花實生苗的試驗研究，實生苗經四川大學生藥教研室張浩教授鑒定為七葉一枝花。基地海拔高度1 020 m，位于103.930°E、30.980°N，土壤為黑壤土。栽培過程中進行常規的田間管理。

1.1.2 儀器與試劑 島津LG-10A高效液相色譜儀，DAD檢測器；D1810D自動純水蒸餾器。乙腈和甲醇均為色譜純，水為雙蒸水。重樓皂苷Ⅰ(111590-200402)、重樓皂苷Ⅱ(111591-200402)均購于中國藥品生物制品檢定所；重樓皂苷Ⅶ、偏諾皂苷-3-O-β-D-葡萄糖(1→3)[α-L-鼠李糖(1→2)]-β-D-葡萄糖(PGGR)、重樓皂苷H、重樓皂苷Ⅵ、纖細薯蕷苷和重樓皂苷Ⅴ這6個對照品都由筆者所在課題組提取分離所得，純度超過98%。

1.2 方法

1.2.1 植株形態、根系、單株產量數量性狀的測定 于2014年10月中旬七葉一枝花地上部分停止生長后，在試驗基地定株測定植株的株高、莖粗、葉片數、葉片長和葉片寬；同時采集地下根莖，其中1年生七葉一枝花植株60株，2～8年生長年限植株各30株，測定主根長、根莖直徑、須根數、須根長、須根寬、鮮質量、干質量等數量性狀。

1.2.2 藥材中皂苷類成分的測定 采集到的藥材低溫干燥后打粉過篩(40目)，應用HPLC法進行皂苷類成分的測定。色譜條件的確立、對照品和供試品溶液的制備、線性關系的考察、精密度試驗、重復性試驗、穩定性試驗、加樣回收試驗、樣品測定的具體方法見陳鐵柱等介紹的方法[8]。藥材留樣憑證標本存放于四川省中醫藥科學院標本室，所有樣品均有原植物數碼照片及原植物標本。

1.2.3 數據分析 方差分析使用SPSS 22.0數據處理軟件。

2 結果與分析

2.1 生長年限對七葉一枝花植株性狀的影響

不同生長年限七葉一枝花的株高、莖粗、葉片數、葉片長、葉片寬有顯著差異(圖1)。隨著年限的增長，株高不斷增加；1～5年生的莖粗增粗明顯，隨后的3年增粗不明顯；葉片數隨著年限不斷增加，8年生葉片數平均達12.5張；葉片長也在不斷增長，其中1～4年生的葉片長增長明顯；葉片寬在 1～5年生間增寬明顯，隨后3年增寬不明顯。

2.2 不同生長年限七葉一枝花的根系性狀分析

不同生長年限七葉一枝花根系數據呈顯著差異(圖2)。隨著年限的增長，主根長逐漸增長，其中1年生和2年生、3年生和4年生、5年生和6年生、7年生和8年生的主根長差異均不顯著，但是每相隔2年其主根長差異均顯著；主根直徑隨著年限的增長不斷增大，但5～8年的主根直徑增大差異不顯著；須根數逐漸增多，其中2年生與3年生、5年生和6年生、7年生和8年生的須根數差異不顯著；1～3年生的須根長和須根直徑差異不顯著，須根直徑從4年生開始每相鄰的2年之間差異不顯著(6～7年生除外)。

2.3 不同生長年限七葉一枝花的單株產量分析

不同生長年限七葉一枝花的鮮質量、干質量、折干率、增質量倍數均差異顯著(圖3)。1年生和2年生、3年生和4年生、6～8年生的鮮質量差異不顯著，隨著年限的增長，根莖鮮質量在不斷增加。1～3年生的干質量差異顯著，3年生和4年生、6～8年生的干質量差異均不顯著，根莖干質量不斷累積增長。1～3年生的折干率差異顯著，隨后的5年折干率差異均不顯著。5年生的年增質量倍數要顯著高于其他年生的增質量倍數，達到7.1倍左右。

2.4 不同生長年限七葉一枝花皂苷含量分析

不同年限的七葉一枝花藥材中的皂苷含量的測定結果見表1。1～8年生的七葉一枝花藥材中均沒有檢測到重樓皂苷Ⅰ；1～7年生七葉一枝花中均沒有檢測到皂苷Ⅱ、纖細薯蕷皂苷和重樓皂苷V，盡管8年生藥材中檢測到皂苷H、纖細薯蕷皂苷和重樓皂苷V，但含量甚微。從不同生長年限藥材中的重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ的總量和重樓總皂苷含量變化曲線(圖4)可以看出，1～5年生的重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ的總量和重樓總皂苷含量呈現逐年下降的趨勢；5～8年生的重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ的總量和重樓總皂苷含量逐年上升。

3 討論與結論

3.1 不同生長年限的七葉一枝花植株性狀、根系性狀、單株產量分析

七葉一枝花作為歷版《中國藥典》收載的法定品種，但研究相對較少，前人研究基礎薄弱。七葉一枝花是多年生植物，植株生長緩慢，生長年限較長，研究周期也比較長[9-10]。同時七葉一枝花種子具有生理后熟和形態后熟的特征，自然條件下至少2年后才能發芽，而且出苗后當年幼苗會長出主根和萌發的芽鞘，葉片也只有1張，要用于大田栽培至少要等到出苗后2～3年，可見育苗周期長。因此，現有關七葉一枝花的實生苗的相關報道非常有限。本試驗對用種子繁殖的1～8年不同生長年限的七葉一枝花植株進行了研究，得到了1～8年的生長變化曲線。結果顯示，隨著年限的增長，七葉一枝花植株性狀、根系性狀、單株產量數據呈逐漸增長的趨勢。其中，5年生的七葉一枝花單株質量增質量倍數要顯著高于其他年生，達到7.1倍左右，說明種植后5年是七葉一枝花快速生長期。

但6、7、8年生之間的莖粗、葉片寬、主根直徑、須根數和須根長之間的差異不顯著，尤其是7年生和8年生植株的株高、莖粗、葉片數、葉片長、葉片寬、主根長、根莖直徑、須根數、須根長、須根寬、鮮質量、干質量沒有顯著差異。說明從種植后6年開始，七葉一枝花植株生長開始放緩，尤其在7年生和8年生表現得更為明顯， 其8年生七葉一枝花平均每株干質量達到23.1 g，其質量與中藥材市場上流通的中小規格的重樓質量相近。因此，用種子繁殖的實生苗，可在種植6年后進行采收。同時，建議繼續深度開展七葉一枝花根莖種苗繁育及栽培技術研究，進行更長生長年限的研究，確定其更完善的技術體系，從而保障七葉一枝花栽培的技術的成熟度，實現規范化栽培。

表1 不同生長年限對七葉一枝花8種重樓皂苷含量的影響

3.2 不同生長年限的七葉一枝花藥材中的皂苷種類和含量分析

生長年限為影響七葉一枝花藥材質量的重要因素之一，搞清楚七葉一枝花化學成分含量隨年限的變化規律，對其合理采收種植有很大意義。本研究連續測定了1～8年生的七葉一枝花藥材中的皂苷類成分含量，結果發現，不同生長年限的七葉一枝花中重樓皂苷主要以偏諾皂苷為主，幾乎沒有檢測到薯蕷皂苷成分重樓皂苷Ⅱ、纖細薯蕷皂苷、重樓皂苷Ⅰ和重樓皂苷Ⅴ。整體上看，重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ的總量和重樓總皂苷含量呈現一個大致“V”字形的變化趨勢，即1～5年生重樓皂苷含量逐年下降，可能由于這5年屬于七葉一枝花的快速生長期(從單株根莖干質量的增質量比率也可以看出是快速增長期)，隨年限的增長，體內積累淀粉等物質呈倍數顯著增長，從而導致其皂苷含量逐漸降低；從種植后5年開始，根莖干質量增質量倍數降低，體內淀粉等物質含量增速放緩，從而導致其皂苷含量逐漸升高。

七葉一枝花的皂苷類成分含量隨生長年限的變化而變化，大部分皂苷類含量并不是隨著生長年限的增長而不斷增加，6年生的重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ的總量和重樓皂苷總含量反而不如4年生，從這個角度看4年生七葉一枝花質量較6年生更好。所以，從質量角度來講，并不是生長年限越長越好。所有生長年限的藥材樣品中，均檢測到重樓皂苷Ⅶ和重樓皂苷H，作為《中國藥典》考察的成分指標重樓皂苷Ⅶ，其含量從種植后1年一直連續下降到種植后4年，從種植后5年開始連續上升到種植后8年，種植8年之后是否還會繼續上升有待于進一步研究。

參考文獻：

[1]中國藥典委員會. 中華人民共和國藥典[M]. 北京：化學工業出版社，2015：260.

[2]陸 輝，許繼宏，陳銳平，等. 云南重樓屬植物資源現狀與保護對策[J]. 云南林業，2006，28(S1)：307-310.

[3]李 恒，蘇 豹，張兆云，等. 中國重樓資源現狀評價及其種植業的發展對策[J]. 西部林業科學，2015，44(3)：1-7，15.

[4]陳鐵柱，林 丹，汪 瑤，等. 四川省具有子根莖重樓的資源調查及品質研究[J]. 安徽農業科學，2015，43(23)：82-85.

[5]李燕敏，丁立帥，王晶晶，等. 基于莖痕判定的不同生長年限重樓藥材中皂苷含量分析[J]. 中國實驗方劑學雜志，2016，22(12)：42-46.

[6]劉立敏，趙志蓮，韓 多，等. 不同生長年限滇重樓干物質積累量及活性成分的積累規律考察[J]. 中國醫藥工業雜志，2016，47(6)：706-710.

[7]趙庭周，王卜瓊，馬 青，等. 滇重樓采收期研究[J]. 中國野生植物資源，2014，33(5)：61-63，66.

[8]陳鐵柱，文飛燕，張 濤，等. 華重樓子根莖種苗規格對植株生長，根系，產量，質量影響研究[J]. 時珍國醫國藥，2016，27(9)：2259-2262.

[9]王 嵐，張宇斌，李建新. 不同栽培基質對七葉一枝花光合特性、生理特性的影響[J]. 江蘇農業科學，2016，44(1)：216-219.[10]梁 娟，易 濤，葉 漪. 遮陰對七葉一枝花光合特性及皂苷含量的影響[J]. 江蘇農業科學，2016，44(4)：265-267.