抗枇杷根腐病病菌的內生木霉菌株篩選

魯海菊， 江 濤， 胡金碧， 毛春誠， 王傳銘

(紅河學院生命科學與技術學院，云南蒙自 661199)

自1998年臺灣地區首次報道枇杷根腐病以來，福建、云南等地區也相繼發生枇杷根腐病，其田間癥狀初期表現出樹勢衰退，葉片變黃脫落，下大雨時，植株發病較快，只留下褐色干枯的葉片掛在死樹枝上，莖基部皮層變暗色，流膠。發病中期莖呈暗褐色，基部腐爛，韌皮部呈魚鱗狀，地上部維管組織呈紅褐色。病株根環腐，不長新根，有白色菌絲。后期植株萎蔫、樹皮脫落、最后整株枯死。云南、臺灣、福建等3個枇杷栽培區，其根腐病癥狀相似，但病原菌各不相同，分別由小孢擬盤多毛孢(Pestalotiopsismicrospora)[1]、寄生疫霉(Phytophthoraparasitica)[2]、帚梗柱孢屬(Cylindrocladiumsp.)真菌[3]引起。經多次分離，云南地區未發現寄生疫霉和帚梗柱孢屬真菌2種病原菌侵染枇杷引起根腐病的情況。枇杷根腐病屬于土傳病害，高溫高濕有利于此病發生，發病高峰期在7、8月份，從出現癥狀到整株死亡，快的需要1個月，慢的也不超過2年，發病率高達40%及以上，且有逐漸加重之勢，每年損失數億元。云南地區的枇杷特色產業正面臨著毀滅性災難，急需高效的防治方法。

近年來，當地植保工作者聯合紅河學院積極探索防治枇杷根腐病的方法，但效果甚微。目前，除了氟菌·霜霉威(銀法利)對枇杷根腐病有一定的控制效果之外，其他農藥都沒有控制效果。另外，由于此病發展迅速，往往來不及防治，植株就已死亡；加之氟菌·霜霉威價格較高(凈含量為25 mL的1袋銀法利市場售價為100元)，沒有得到有效推廣應用。可見，化學防治未能有效控制枇杷根腐病。另外，化學防治土傳病害存在施藥困難、成本高、容易引起殘留及環境污染等問題。枇杷抗病育種工作目前相對滯后，在枇杷中尋找抗枇杷根腐病的基因，成功培育出抗枇杷根腐病的抗性品種，在短期內難以實現。目前看來，生物防治是一種經濟有效的控制枇杷根腐病的方法。

魯海菊等報道，內生木霉P3.9菌株對枇杷根腐病病菌(P.microspora)有強烈的抑制作用[4]，抗菌譜廣[5]，對枇杷內生真菌[6]及其根際土壤真菌[7]均有極強的抑制作用。P3.9菌株能成功定殖于枇杷主干及其根際土壤中，盆栽防治效果高達80%，且具有固氮、抗化學農藥、降解難溶磷酸鹽、降解纖維素等多種功能(未發表)，具有廣闊的開發應用前景。雖然目前木霉P3.9菌株是防治枇杷根腐病良好的菌種資源，但也存在菌種衰退的風險。因此，筆者從黃瓜及枇杷中分離得到12株內生木霉，擬測定其對枇杷根腐病病菌的抑制作用，篩選出更多能防治枇杷根腐病的優良木霉菌株，以期為此病害的綠色防控提供菌種資源及理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試菌株 12株內生木霉(Trichodermaspp.)菌株，分別分離自黃瓜的莖(菌株J1、J2、J3、J4、J5、JD3)、根(菌株GD3、GD5、GM6)、葉(菌株Y2)及枇杷主干韌皮部(菌株PZ1、P3.9)。枇杷根腐病病菌(P.microspora)，分離自枇杷根腐病病株根莖韌皮部。

1.1.2 供試培養基 PDA培養基：200.0 g馬鈴薯、18.0 g葡萄糖、13.5 g瓊脂、1 000 mL蒸餾水。PD培養基：200 g馬鈴薯、18 g葡萄糖、1 000 mL蒸餾水。將上述培養基配好后均在121 ℃高壓滅菌30 min。材料均購自云南省蒙自市農貿中心及云南科儀化玻有限公司，試劑均為分析純。

1.2 試驗方法

1.2.1 對峙培養 將枇杷根腐病病菌和各供試木霉菌株在PDA平板培養基中，于28 ℃恒溫培養5 d，采用對峙培養法[8]，在培養基同一半徑周圍，用打孔器取直徑為5 mm的菌餅，將木霉與病菌兩兩組合，同時接種于無菌PDA平板(直徑 90 mm)中，2個接種點相距45 mm，以不接種木霉菌作為對照，設3次重復，在28 ℃恒溫培養，第7天測定病菌的菌落直徑，計算其生長抑制率。抑制率=[(dCK-dB)/dCK]×100%，其中dCK表示對照菌落直徑，dB表示處理菌落直徑。

1.2.2 拮抗等級測定 拮抗等級分級標準參照張瑾等的分級標準，Ⅰ：木霉菌菌落占據培養皿面積的100%；Ⅱ：3/4<木霉菌菌落占據培養皿面積<100%；Ⅲ：2/3<木霉菌菌落占據培養皿面積≤3/4；Ⅳ：木霉菌菌落占據培養皿面積≤2/3[9]。

1.2.3 木霉P3.9菌株液體培養 將木霉菌株接種在PDA培養基平板中，于28 ℃恒溫擴大培養3 d，用滅菌蒸餾水沖洗孢子，制成孢子懸浮液(1.5×106個/mL)備用[10]，分別在 500 mL 錐形瓶中裝入250 mL PD發酵培養液，同時接種2 mL孢子懸浮液，于28 ℃、180 r/min 搖床中培養7 d。然后真空抽濾菌絲體，制成濾液備用。

1.2.4 木霉P3.9菌株次生代謝產物對枇杷根腐病病菌的抑制作用測定 把“1.2.3”節中獲得的木霉發酵濾液，在121 ℃高壓蒸汽滅菌30 min，待冷卻至45～50 ℃時，按照25%、50%、75%的比例加入已滅菌的PDA培養基中倒平板。另一處理將上述濾液在50 ℃水浴2 h，按照前述比例加入PDA培養基中倒平板。打取直徑為5 mm的枇杷根腐病病菌菌餅，分別接種于上述準備好的2種平板中央，以不加木霉發酵液的PDA平板接種病菌菌餅作為對照。每個處理設3個重復。第7天測量菌落直徑。

1.2.5 木霉P3.9菌株揮發性物質對枇杷根腐病病菌的抑制作用測定 將枇杷根腐病病菌和木霉菌株在PDA平板培養基中，28 ℃恒溫擴大培養3 d，打取直徑為5 mm的枇杷根腐病病菌菌餅分別接種于PDA平板中央，兩培養皿對口，用膠帶封口固定。以只接病菌的PDA平板作對照。每個處理設3個重復。第7天測量菌落直徑。

1.3 數據統計

所有試驗數據均采用SPSS 19.0統計軟件Duncan’s多重比較法進行統計分析，計算各處理之間的差異性。

2 結果與分析

2.1 木霉菌株對枇杷根腐病病菌的抑制作用

由表1可知，12株內生木霉對枇杷根腐病病菌的抑制率均大于50%，具有較強的抑菌作用。相比較而言，P3.9、JD3菌株的抑菌率與其他菌株的抑菌率差異極顯著(P<0.01)，抑菌率較高，分別達到80.1%、78.1%。說明這2個菌株的生防潛力最大。P3.9菌株分離自枇杷主干韌皮部，理論上更容易定殖于枇杷根際及其植株中，生防潛力較大。

表1 木霉菌株對枇杷根腐病病菌的抑制作用

注：數據后不同小寫、大寫字母分別表示在0.05、0.01水平上差異顯著。表3同。

2.2 木霉菌株對枇杷根腐病病菌的拮抗等級

由表2可知，12株內生木霉對枇杷根腐病病菌均有拮抗作用。其中，菌株P3.9、JD3的拮抗等級為Ⅱ，菌株Y2的拮抗等級為Ⅳ，其余菌株的拮抗等級均為Ⅲ。由圖1可知，J1、J3、J5、JD3、GD3、GD5、PZ1、P3.9等8個菌株菌絲覆蓋病菌的同時，其上產生木霉分生孢子，J1、JD3、GD3、GD5等4個菌株產生的孢子量相對較多；GM6、Y2菌株不產生分生孢子。

2.3 木霉P3.9菌株次生代謝產物對枇杷根腐病病菌的抑制作用

由表3可知，內生木霉P3.9菌株發酵濾液在50 ℃水浴2 h，低濃度發酵液(25%、50%)對枇杷根腐病病菌幾乎沒有抑制作用，抑菌率均小于2%，高濃度發酵液(75%)對病菌有較強的抑制作用，抑菌率達78.9%，且病菌周圍長滿木霉分生孢子(圖2)。內生木霉P3.9菌株發酵濾液經121 ℃高壓蒸汽滅菌，高、低濃度均對枇杷根腐病病菌幾乎沒有抑制作用，抑菌率均小于5%。說明P3.9菌株次生代謝產物遇高溫失活，喪失對枇杷根腐病病菌的抑制作用(圖3)。

2.4 木霉P3.9菌株揮發性物質對枇杷根腐病病菌的抑制作用

枇杷根腐病病菌和木霉P3.9菌株在28 ℃恒溫對扣培養7 d，對照病菌菌落直徑為88.0 mm，處理病菌菌落直徑為 62.3 mm，抑菌率為29.2%。說明P3.9菌株的揮發性物質對枇杷根腐病病菌的抑制作用很小(圖4)。

3 結論與討論

12株內生木霉對枇杷根腐病病菌均有較強的抑制作用，抑菌率均大于50%。其中，P3.9菌株的抑菌率最高，達 80.1%，其次為JD3菌株，其抑菌率為78.1%。P3.9菌株對枇杷根腐病病菌除了空間及營養競爭、重寄生之外，適當濃度的液體發酵濾液對病原菌的抑制作用也較強。說明木霉 P3.9 菌株能產生抑制枇杷根腐病病菌的次生代謝產物，其揮發性次生代謝產物也具有一定的抑菌作用。JD3菌株產孢能力比P3.9菌株強，其他生物學特性是否也強于P3.9菌株，還有待進一步研究。P3.9、JD3菌株對枇杷根腐病病菌的拮抗等級均為Ⅱ，Y2菌株的拮抗等級為Ⅳ，其余菌株的拮抗等級均為Ⅲ，有潛在的開發利用價值。可以考慮開發復合木霉菌劑，或與化學農藥混配，以提高防病效果。

表2 木霉菌株對枇杷根腐病病菌的拮抗等級

我國化肥和農藥過量施用現象嚴重，因此引起環境污染和農產品質量安全等重大問題，農作物綠色防控的呼聲越來越高。木霉是目前在微生物生防資源中重要的物種之一，自2013年以來，我國已用木霉菌劑成功防治玉米小斑病[11]、黃瓜根結線蟲病[12-13]、柑橘綠霉病[14]、黃瓜枯萎病[15]、茄子黃萎病[16]、人參銹腐病[17]、草莓根腐病[18]、草坪枯萎病[19]、水稻紋枯病[20]、向日葵菌核病[21]、茉莉白絹病[22]、香蕉枯萎病[23]、葡萄灰霉病[24]等多種作物病害。木霉P3.9菌株抗菌譜廣[5]，有望防治枇杷根腐病、石榴枯萎病和干腐病、菊花根腐病和葉斑病、辣椒黃萎病等。其在作物根際土壤及植株中的定殖規律，對土壤微生物數量的影響及防病效果影響因素，有待進一步研究。

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表3 木霉P3.9菌株次生代謝產物對枇杷根腐病病菌的抑制作用

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