油葵轉(zhuǎn)基因方法的比較

焦 展， 安勝軍， 邵鐵梅， 李 雪， 劉 培

(1.河北化工醫(yī)藥職業(yè)技術(shù)學(xué)院/河北省高校生物反應(yīng)器與蛋白類藥物開發(fā)應(yīng)用技術(shù)研發(fā)中心，河北石家莊 050026；2.河北中醫(yī)學(xué)院，河北石家莊 050091)

油用向日葵(HelianthusannuusL.)別稱油葵，是重要的油料作物之一。向日葵基因轉(zhuǎn)化研究中較成功的方法多是以離體培養(yǎng)為基礎(chǔ)的農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，外植體包括莖尖、成熟胚子葉、下胚軸、未成熟胚、原生質(zhì)體等[1-7]；而關(guān)于油葵的轉(zhuǎn)化研究相對(duì)很少[8]。另外，受基因型限制，再生率低、抗性愈傷分化率低、生根難導(dǎo)致獲得完整轉(zhuǎn)化植株困難，基因槍轉(zhuǎn)化穩(wěn)定整合率較低，且極易發(fā)生早花——這些離體培養(yǎng)中的問題嚴(yán)重限制了向日葵尤其是油葵的遺傳轉(zhuǎn)化研究進(jìn)程。因此，本試驗(yàn)借助GUS組織化學(xué)染色，分別對(duì)油葵的去1張子葉轉(zhuǎn)化法和溫室子葉節(jié)轉(zhuǎn)化法、花粉管通道柱頭滴加轉(zhuǎn)化方法和子房注射轉(zhuǎn)化方法進(jìn)行比較研究，驗(yàn)證了簡(jiǎn)便易行且效率較高的油葵轉(zhuǎn)基因方法。同時(shí)，這些轉(zhuǎn)化方法最低限度涉及或者完全不涉及離體培養(yǎng)，避免發(fā)生離體早花現(xiàn)象，能夠獲得完整的轉(zhuǎn)化植株。本研究為優(yōu)化油葵轉(zhuǎn)基因體系提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

以羅馬尼亞油葵“精選”恢復(fù)系為試材，由河北省半干旱研究中心河北華豐種業(yè)惠贈(zèng)。GUS基因轉(zhuǎn)化試驗(yàn)所用雙元表達(dá)載體為pBI121：：GUS，根癌農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)菌株為L(zhǎng)BA4404，均由本實(shí)驗(yàn)室保存；含胰島素基因的植物表達(dá)載體pBINOI由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保存[9]。

1.2 方法

1.2.1 農(nóng)桿菌懸菌液的制備 接種農(nóng)桿菌單菌落于液體YEB(5 mL)中。200 r/min、28 ℃振蕩培養(yǎng)過夜，再次接種于100 mL液體YEB中(接種比例1 ∶100)，繼續(xù)振蕩8～16 h。離心(4 000 r/min、4 ℃、10 min)收集菌體，用pH值7.0的MS液體(含100 μmol/L乙酰丁香酮)重懸，備用。

1.2.2 去1張子葉轉(zhuǎn)化法 挑選飽滿的油葵種子約150粒，用無菌水浸泡過夜。在超凈臺(tái)上去殼后放入無菌瓶，用75%乙醇消毒50 s，后用5% NaClO消毒9 min，無菌水沖洗4～5次，每次1 min，最后加入1/2MS液體。封好瓶口放于搖床，130 r/min、27 ℃振蕩培養(yǎng)一定時(shí)間。振蕩培養(yǎng)時(shí)間設(shè)6個(gè)處理，即0、6、12、24、36、48 h，重復(fù)3次。

用無菌手術(shù)刀在萌發(fā)種子的子葉節(jié)部位斜切，并在解剖鏡下去掉2張已萌發(fā)的幼葉和可見的葉原基，露出生長(zhǎng)點(diǎn)部位(可借助解剖鏡保證去除隱藏的幼葉)，并用注射器針頭刺傷該區(qū)域，將該部分作為外植體備用。

侵染和培養(yǎng)方法參照RAO的方法[10]并加以改進(jìn)。用含GUS基因的LBA4404農(nóng)桿菌懸菌液浸泡侵染外植體30 min，隨后用無菌濾紙吸干水分，放置于1/2MS固體培養(yǎng)基，共培養(yǎng)3 d。

1.2.3 溫室子葉節(jié)轉(zhuǎn)化法(別稱溫室莖尖轉(zhuǎn)化法) 溫室苗床播種油葵種子，待幼苗萌發(fā)后，2張子葉微張至約60°角時(shí)，用手術(shù)刀片于子葉節(jié)部位斜切去除1張子葉，或從2張子葉中間生長(zhǎng)點(diǎn)部位縱切，使生長(zhǎng)點(diǎn)裸露，并用注射器針頭刺傷(可借助解剖鏡保證去除隱藏的幼葉)。將制備好的懸菌液用注射器注入生長(zhǎng)點(diǎn)部位，并用脫脂棉沾濕菌液覆于生長(zhǎng)點(diǎn)部位3 d，保持黑暗并每天噴水保濕。3 d后摘掉無菌棉，光周期16 h/8 h培養(yǎng)至長(zhǎng)出2～3張新的完整葉片。由于操作部位為子葉節(jié)區(qū)域，而侵染部位位于莖尖附近，因此本研究中溫室子葉節(jié)轉(zhuǎn)化法別稱溫室莖尖轉(zhuǎn)化法。

1.2.4 質(zhì)粒提取方法 質(zhì)粒的提取方法參照文獻(xiàn)[11]。導(dǎo)入液終濃度約為100 ng/μL，-20 ℃保存。操作時(shí)質(zhì)粒須冰浴保存。

1.2.5 花粉管通道柱頭滴加轉(zhuǎn)化法 對(duì)管狀花進(jìn)行人工授粉，1～9 h后剪掉萎蔫的柱頭，用微量進(jìn)樣器將質(zhì)粒DNA溶液滴加到花柱上，每次5 μL，滴加3次。操作完成后用保鮮袋保濕2 h，隨花盤開放每天由外而內(nèi)操作，直至最內(nèi)層的管狀花開放完畢。授粉后減掉柱頭的時(shí)間設(shè)1、3、5、7、9 h等5個(gè)處理，種子收獲后統(tǒng)計(jì)結(jié)實(shí)率(結(jié)實(shí)率=結(jié)實(shí)小花數(shù)/操作小花數(shù)×100%)，后代經(jīng)PCR檢測(cè)統(tǒng)計(jì)植株陽性率(植株P(guān)CR陽性率=PCR陽性植株數(shù)/該代植株總數(shù)×100%)。

1.2.6 花粉管通道子房注射轉(zhuǎn)化法 在人工授粉24～36 h后，撕開花冠和花絲筒，使子房暴露，針刺子房頂部正中部位，將25 μL微量進(jìn)樣器伸入子房，注射DNA溶液10 μL，重復(fù)3次。其他方面(保濕、操作順序、結(jié)實(shí)率和陽性率)同柱頭滴加法。

1.2.7 GUS基因表達(dá)的組織化學(xué)染色分析 利用pBI121：：GUS質(zhì)粒進(jìn)行花粉管通道轉(zhuǎn)化，3 d后進(jìn)行GUS組織染色，并觀察幼胚染色情況。28 d后進(jìn)行后代種子染色，觀察種子染色情況。同時(shí)，設(shè)陰性對(duì)照(非轉(zhuǎn)化的同步材料)，觀察染色(染色方法及配方參照J(rèn)efferson的方法[12])情況。

1.2.8 轉(zhuǎn)胰島素基因油葵的PCR檢測(cè) 方法比較完成后，使用含有胰島素基因的LBA4404農(nóng)桿菌菌株(載體結(jié)構(gòu)見參考文獻(xiàn)[9])，再次侵染去1張子葉外植體，3 d后轉(zhuǎn)入MS+70 mg/L卡那霉素+300 mg/L頭孢噻肟鈉進(jìn)行篩選。15 d后將抗性植株(根保留較多的)移栽入蛭石，或者將抗性芽進(jìn)行嫁接(砧木采用2周齡同品種油葵幼苗)，以得到完整抗性植株，取植株上部新長(zhǎng)出的葉片提取基因組進(jìn)行PCR檢測(cè)。PCR陽性植株上收獲種子，播種長(zhǎng)出T1代植株取新鮮葉片進(jìn)行基因組提取，并進(jìn)行PCR檢測(cè)。進(jìn)行溫室子葉節(jié)轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化后取植株上部新長(zhǎng)出的葉片提取基因組，進(jìn)行PCR檢測(cè)收獲陽性植株種子，播種長(zhǎng)出T1代植株取新鮮葉片提取基因組，并進(jìn)行PCR檢測(cè)。提取含胰島素的基因的質(zhì)粒進(jìn)行花粉管通道柱頭滴加或子房注射轉(zhuǎn)化。進(jìn)行轉(zhuǎn)化的植株(T0代)收獲的種子播種長(zhǎng)出新植株(T1代)，取T1代鮮嫩葉片提取基因組進(jìn)行PCR檢測(cè)，其引物為：上游5′-CGGGGTACCTCG TCTAAATTTCAGCCTATCGACG-3′，下游5′-CGAGCTCTTA GTTGCAGTAATTTTCTAG-3′。

1.2.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析 數(shù)據(jù)用Excel 2010和分析軟件DPS 7.05處理，顯著水平0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 利用GUS組織染色比較去1張子葉和溫室子葉節(jié)轉(zhuǎn)化效率

由于去1張子葉轉(zhuǎn)化法和溫室子葉節(jié)轉(zhuǎn)化法2種方法的轉(zhuǎn)化原理和被侵染材料類似，首先比較這2種方法的轉(zhuǎn)化效果。用含GUS基因的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化去1張子葉實(shí)生株和子葉微張的溫室幼苗(溫室子葉節(jié)轉(zhuǎn)化)。對(duì)轉(zhuǎn)化后的材料進(jìn)行GUS組織化學(xué)染色。參考文獻(xiàn)[13]擬定3個(gè)級(jí)別：Ⅰ級(jí)，GUS染色程度深，著色位點(diǎn)在子葉節(jié)及莖尖周圍，藍(lán)色部分連成片狀，面積超過分生區(qū)的2/3；Ⅱ級(jí)，GUS染色程度一般，在莖尖區(qū)域及其周圍有許多藍(lán)色著色位點(diǎn)；Ⅲ級(jí)，GUS染色程度很淺，僅個(gè)別部位有零星藍(lán)色斑點(diǎn)(圖1)。2種方法各選用100個(gè)幼苗作為侵染材料(重復(fù)3次)，侵染后3 d對(duì)侵染材料進(jìn)行GUS組織化學(xué)染色。分別統(tǒng)計(jì)處于各染色級(jí)別的外植體的數(shù)目，各級(jí)別GUS瞬時(shí)表達(dá)率=相應(yīng)級(jí)別的GUS瞬時(shí)表達(dá)著色材料數(shù)/侵染材料總數(shù)×100%；總GUS瞬時(shí)表達(dá)率=GUS瞬時(shí)表達(dá)著色材料總數(shù)/侵染材料總數(shù)×100%。結(jié)果表明，通過去1張子葉侵染方法得到的轉(zhuǎn)化材料明顯多于通過溫室子葉節(jié)轉(zhuǎn)化方法得到的材料。去1張子葉侵染方法得到的GUS瞬時(shí)表達(dá)效率可達(dá)41.20%，而后者僅為13.36%(表1)。圖2為去1張子葉轉(zhuǎn)化法得到的GUS染色陽性植株(3 d)。因此，在后序研究中多采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的去1張子葉轉(zhuǎn)化方法進(jìn)行侵染，并作為轉(zhuǎn)化胰島素基因的主要方法之一。

2.2 利用GUS組織染色比較柱頭滴加法和子房注射法的轉(zhuǎn)化效率

利用pBI121：：GUS質(zhì)粒進(jìn)行花粉管通道法轉(zhuǎn)化。同上，利用組織化學(xué)染色的方法對(duì)2種方法的GUS基因的3 d后瞬時(shí)表達(dá)效率進(jìn)行比較，擬定3個(gè)級(jí)別：Ⅰ級(jí)，GUS染色程度深，整個(gè)幼胚都著色；Ⅱ級(jí)，GUS染色程度一般，著色部位約占幼胚1/2；Ⅲ級(jí)，GUS染色程度很淺，僅≤1/3面積的幼胚能夠著色(圖3)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，柱頭滴加法GUS表達(dá)效率明顯高于子房注射法，分別為17.33%、9.33%(表2)。此外，經(jīng)柱頭滴加法進(jìn)行花粉管通道轉(zhuǎn)化油葵28 d后取未成熟胚進(jìn)行組織染色，可觀察到轉(zhuǎn)化材料可被染為藍(lán)色(圖4)。說明GUS基因在油葵種子上不僅轉(zhuǎn)化后3 d能夠瞬時(shí)表達(dá)，而且轉(zhuǎn)化后 28 d 也能夠表達(dá)，28 d表達(dá)率分別為11.92%、3.98%，差異顯著(表3)。因此，油葵花粉管通道法轉(zhuǎn)基因方法中柱頭滴加法優(yōu)于子房注射法。

2.3 轉(zhuǎn)胰島素基因油葵的獲得

2.3.1 4種轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)胰島素基因油葵的PCR檢測(cè) 本試驗(yàn)研究的4種方法都獲得了轉(zhuǎn)胰島素基因PCR陽性植株(圖5)，去1張子葉法和花粉管通道法比較適宜，其余2種方法也能夠獲得轉(zhuǎn)基因PCR陽性植株，但從轉(zhuǎn)化率方面和操作簡(jiǎn)便易行方面優(yōu)選去1張子葉轉(zhuǎn)化和花粉管通道轉(zhuǎn)化的方式，作為后續(xù)研究油葵的主要轉(zhuǎn)化方式。

表1 2種轉(zhuǎn)化方法材料的GUS瞬時(shí)表達(dá)效率比較(去1張子葉轉(zhuǎn)化法和溫室子葉節(jié)轉(zhuǎn)化法)

2.3.2 去1張子葉法T0和T1代轉(zhuǎn)胰島素基因油葵的獲得 去1張子葉法轉(zhuǎn)化油葵，轉(zhuǎn)化操作時(shí)間點(diǎn)的選擇對(duì)轉(zhuǎn)化效率影響很大。結(jié)果(圖6)表明，種子萌發(fā)后36 h對(duì)萌發(fā)的種子切去1張子葉，然后進(jìn)行農(nóng)桿菌侵染，轉(zhuǎn)化后抗性率和陽性率明顯高于其他處理，分別為12.83%、3.17%。

表2 2種轉(zhuǎn)化方法材料的GUS瞬時(shí)表達(dá)效率比較(柱頭滴加法和子房注射法)

表3 柱頭滴加法和子房注射法轉(zhuǎn)化后3、30 d材料的GUS表達(dá)效率比較

供試的600株去1張子葉無菌苗經(jīng)農(nóng)桿菌侵染、篩選、移栽或嫁接，共得到40株完整抗性植株(T0代)，經(jīng)檢測(cè)得到19株T0代陽性植株(表4)，PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)化率可達(dá)到 3.17%。培養(yǎng)過程中，由于離體培養(yǎng)的部分植株瘦弱，生根困難，移栽后很難成活。針對(duì)此問題，將嫁接的方法應(yīng)用于本研究中，即使是無根組培苗，通過嫁接也可得到完整植株。但是，因嫁接成活率和抗性植株強(qiáng)壯程度不確定，得到完整抗性植株數(shù)量仍然較少。從T0代植株上收獲種子，播種長(zhǎng)出T1代植株，取其幼嫩葉片提取基因組，PCR結(jié)果顯示，8個(gè)T0代陽性植株的后代均檢測(cè)到陽性T1代植株。但該方法由于侵染和培養(yǎng)過程中對(duì)幼苗有傷害，T0代植株得到的種子量較少，每株植株僅5～30粒種子。

2.3.3 花粉管通道法(柱頭滴加法)轉(zhuǎn)胰島素基因油葵的獲得 利用花粉管通道柱頭滴加轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化600朵小花，結(jié)實(shí)率可達(dá)52.83%，轉(zhuǎn)化率為10.83%(表5)。為獲得更高的轉(zhuǎn)化效率，本試驗(yàn)研究了人工授粉后柱頭剪切時(shí)間對(duì)結(jié)實(shí)率和轉(zhuǎn)化率的影響。結(jié)果表明，授粉后5～9 h結(jié)實(shí)率、5～7 h轉(zhuǎn)化率均顯著高于其他處理(圖7)。綜合考慮，授粉后5～7 h是花粉管通道柱頭滴加法最佳操作時(shí)間，利用此方法對(duì)油葵進(jìn)行轉(zhuǎn)化，可獲得轉(zhuǎn)胰島素基因油葵陽性植株(圖8)。此方法也可作為油葵轉(zhuǎn)基因研究的主要技術(shù)方法之一。

表4 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的去1張子葉侵染法對(duì)油葵的轉(zhuǎn)化

表5 花粉管通道(柱頭滴加法)對(duì)油葵的轉(zhuǎn)化

3 討論與結(jié)論

利用GUS組織化學(xué)染色的方法可以方便直觀地分析轉(zhuǎn)基因效果，這在前人研究中已有報(bào)道[13-14]。本研究也利用這種方法篩選出適宜油葵基因轉(zhuǎn)化的方法，而后續(xù)研究證明花粉管通道柱頭滴加轉(zhuǎn)化法和去1張子葉轉(zhuǎn)化法是油葵轉(zhuǎn)基因切實(shí)可行的方法，并由此得到了轉(zhuǎn)化植株和后代。

有研究發(fā)現(xiàn)，溫室子葉節(jié)轉(zhuǎn)化法在大豆轉(zhuǎn)基因研究中的效果良好[14]。而本研究發(fā)現(xiàn)去1張子葉轉(zhuǎn)化法優(yōu)于子葉節(jié)轉(zhuǎn)化法，其原因可能是種子萌發(fā)的過程中，在無菌條件下更容易把握去除成熟胚生長(zhǎng)點(diǎn)的時(shí)機(jī)。而溫室條件下，種子萌發(fā)過程須要拱土，這需要2～3 d的時(shí)間。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)種子萌發(fā)后，多數(shù)生長(zhǎng)點(diǎn)已經(jīng)長(zhǎng)出幼葉，錯(cuò)失了拔除生長(zhǎng)點(diǎn)的有利時(shí)機(jī)。因此，對(duì)于油葵轉(zhuǎn)基因來說，去1張子葉轉(zhuǎn)化法更為適宜。然而受限于轉(zhuǎn)基因植株本身的生理狀況，去1張子葉轉(zhuǎn)化法所得到的種子數(shù)量有限，這給后代遺傳分析和純系的篩選會(huì)造成不利影響。這些問題有待進(jìn)一步解決。

本研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)于花粉管通道的2種方法而言，柱頭滴加法優(yōu)于子房注射法，原因可能是油葵小花數(shù)目多，尺寸小，子房相對(duì)較小，而且管狀花的構(gòu)造不利于找準(zhǔn)子房位置，給操作帶來不便；且子房注射法對(duì)子房和胚珠有不同程度的傷害，影響結(jié)實(shí)率，這和前人的研究觀點(diǎn)[15-18]一致。對(duì)于柱頭滴加法，操作時(shí)間對(duì)結(jié)果影響很大，時(shí)間太短花粉管沒有生長(zhǎng)，則質(zhì)粒DNA無法隨花粉管導(dǎo)入，時(shí)間太長(zhǎng)受精已經(jīng)完成，也失去導(dǎo)入時(shí)機(jī)。本研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)油葵花粉管通道柱頭滴加法轉(zhuǎn)化時(shí)機(jī)應(yīng)選擇人工授粉后5～7 h，結(jié)實(shí)率和轉(zhuǎn)化率均較高。

本試驗(yàn)利用GUS組織化學(xué)染色的方法比較了4種油葵轉(zhuǎn)基因方法的效果，并通過轉(zhuǎn)化胰島素基因?qū)D(zhuǎn)化方法進(jìn)行了驗(yàn)證，優(yōu)選出去1張子葉轉(zhuǎn)化法和花粉管通道轉(zhuǎn)化法，這2種方法可作為后續(xù)研究油葵的主要技術(shù)手段，可為向日葵等菊科植物基因工程育種研究提供技術(shù)方法的參考。

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