馬氏珠母貝GAPDH基因克隆及其在去甲基化受精卵中的表達分析

李耀國， 孫 彤， 武文麗， 陳永志， 蔣丹尼

(海南熱帶海洋學院生命科學與生態學院，海南三亞 572022)

甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)，是參與糖酵解等能量代謝反應中的關鍵酶，還具有修復DNA、調節組蛋白、促進細胞凋亡等一系列功能，是一種參與多種亞細胞水平活動的多功能蛋白質[1]。GAPDH廣泛存在于眾多生物體中，在細胞中含量占總蛋白質的10%～20%；種屬間序列高度保守，因在同種細胞或不同組織中蛋白質表達量相對恒定而常作為管家基因[2]。其分子一般為4個相同亞基構成的四聚體，每個亞基含催化結構域和輔酶結合結構域[3]。水產動物中已有GAPDH基因的cDNA全長序列克隆及相關研究。如半滑舌鰨GAPDH基因的開放閱讀框全長序列為1 002 bp，編碼333個氨基酸的多肽鏈[4]。外因刺激可以改變GAPDH的表達水平，雌性食蚊魚暴露在不同濃度雙氯芬酸鈉后肝臟GAPDH的表達量出現顯著變化[5]。

DNA鏈上存在一種甲基化修飾，被視為基因表達的“沉默標記”，它可通過甲基基團的空間位阻效應或促使阻抑蛋白與甲基化DNA相結合而抑制基因表達[6]。去甲基化試劑5-氮雜胞苷能整合到DNA鏈中，抑制甲基化轉移酶的活性使基因或基因組去甲基化，進而調節基因的表達[7-8]。

馬氏珠母貝(Pinctadafucata)是中國南部沿海廣泛分布的一種珍珠貝。目前，尚未見馬氏珠母貝GAPDH基因全長cDNA序列的相關報道。本研究對馬氏珠母貝GAPDH基因的全長cDNA進行了克隆及生物信息學分析，并探索了去甲基化試劑對受精卵中GAPDH基因表達水平的影響，以期為后續GAPDH的功能研究提供基礎。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

試驗用馬氏珠母貝采集自中國科學院大亞灣海洋生物綜合實驗站(深圳)，于實驗基地海水池中暫養1周。取健康馬氏珠母貝外套膜組織，迅速轉移至-80 ℃液氮罐中保存待用。此外，設立3組馬氏珠母貝雌、雄親本單對配對的人工授精試驗。分別將每組單對配對親本產生的精子和卵細胞混合形成受精卵，并將每組分成兩大部分，對照組采用滅菌海水處理10 min，試驗組用10-5mol/L 5-氮雜胞苷溶液處理 10 min。處理后分別采集各組受精卵樣品于液氮保存待用。

1.2 核酸提取及cDNA模板合成

樣品總RNA的提取按照廣州美基公司的核酸提取試劑盒說明書操作，提取后的RNA稀釋于超純水中，利用1.2%瓊脂糖凝膠電泳和Nanodrop分光光度計D260 nm/D280 nm值分析核酸的完整性和測定核酸濃度。RACE試驗所用cDNA模板合成按SMARTerTMRACE(rapid amplification of cDNA ends)cDNA Amplification Kit(Clontech，USA)說明書進行。熒光定量PCR檢測所用cDNA模板按照ReverTra Ace-first-strand cDNA synthesis kit(TOYOBO，Japan)試劑盒說明書進行合成。

1.3 GAPDH cDNA全長序列克隆

基于轉錄組測序所得馬氏珠母貝對應GAPDH基因的Unigene序列(603 bp)，應用Primer Premier 5.0軟件設計RACE PCR所需正、反向引物，引物由華大基因廣州分公司合成。引物分別為5′ 端RACE外引物GARA5-1和5′ 端內引物GARA5-2；3′ 端RACE外引物GARA3-1和3′ 端內引物GARA3-2。RACE PCR外擴增的反應體系為25 μL，包含：12.5 μL Premix ExTaq(TaKaRa，大連)，1 μL cDNA模板，1 μL 10 pmol/L 基因5′端或3′端外引物，1 μL 10 pmol/L的UPM mix引物(由UPM long和UPM short引物混合配制而成)，加ddH2O 9.5 μL。擴增程序為：94 ℃ 5 min；5個循環的94 ℃ 45 s，60 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min；15個循環的94 ℃ 45 s，58 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min；15個循環的94 ℃ 45 s，56 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min；最后在72 ℃下延伸5 min。將第一輪RACE外擴增PCR產物稀釋30倍作為第二輪內擴增PCR反應的模板，內擴增PCR體積為25 μL ∶12.5 μL Premix ExTaq，1 μL稀釋的產物模板，1 μL對應的 5′ 端或3′ 端10 pmol/L內引物，1 μL 10 pmol/L NUP引物，加ddH2O 9.5 μL。反應程序為：94 ℃ 5 min；35個循環的94 ℃ 45 s，56 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min；72 ℃下延伸5 min。取5 μL PCR產物瓊脂糖凝膠電泳后，切取單一條帶，膠純化，送華大基因廣州分公司轉菌落測序。

1.4 序列分析

通過NCBI(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov)中Blast程序進行2個序列比對分析，將獲得的5′端或3′端cDNA序列以及轉錄組GAPDH對應Unigene序列進行拼接得到GAPDH基因全長cDNA序列。GAPDH基因的開放閱讀框預測由NCBI中在線軟件ORF Finder分析完成。利用ProtParam軟件分析該基因的蛋白質分子量、理論等電點等信息。SignalP-4.1 server http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)預測GAPDH蛋白的信號肽序列。在線軟件TMHMM Server 2.0預測跨膜結構，PSORT Prediction軟件預測亞細胞定位點。蛋白質的三級結構由Swiss-Model在線服務器(http：//swissmodel.expasy.org/)進行預測。GAPDH蛋白質的氨基酸殘基序列同源性比對由ClustalW1.83軟件完成，利用MEGA 5.0軟件共同完成系統進化樹的構建(采用鄰接法，并設置Bootstrap值為1 000)。

1.5 熒光定量分析

基于獲得的GAPDHcDNA全長序列設計熒光定量PCR引物GAPDHF和GAPDHR進行基因表達量檢測。對馬氏珠母貝3個單對配對親本產生的對照組和試驗組受精卵樣品中GAPDH的表達量進行檢測，選用的內參基因為馬氏珠母貝18S(GenBank登錄號：AY028625.1，引物為18S F和18S R)。熒光定量PCR反應在Roche LightCycler480儀器中進行。反應體系如下：5 μL 2×SYBR Premix ExTaqTM(TaKaRa)，1 μL模板cDNA，熒光定量引物各0.4 μL(10 μmol/L)，加3.2 μL去離子水使總體積為10 μL。反應條件為：95 ℃ 1 min；45個循環的95 ℃ 5 s，54 ℃ 15 s，72 ℃ 60 s。PCR產物特異性根據溶解曲線作出判斷，基因的相對表達量通過Ct方法計算。利用SPSS 19.0軟件卡方檢驗比較組間GAPDH基因表達水平差異，顯著性水平設置為P<0.05，本試驗中所有引物序列見表1。

表1 GAPDH基因cDNA克隆及熒光定量表達引物

2 結果與分析

2.1 GAPDH基因cDNA全長序列的獲得

基于馬氏珠母貝轉錄組測序所得GAPDHUnigene序列進行RACE PCR。擴增得到了長度為281 bp的5′端和 1 088 bp 的3′端產物(圖1)。拼接5′末端序列、3′末端序列和Unigene序列得到了全長為1 174 bp的GAPDH基因cDNA序列。該cDNA序列的ORF長度為1 014 bp，編碼337個氨基酸，起始密碼子為ATG，終止密碼子為TAA。序列的5′端存在38 bp的非翻譯區，3′端存在122 bp的非翻譯區(圖2)。

2.2 GAPDH基因編碼蛋白質特征分析

對GAPDH基因編碼的蛋白質序列進行生物信息學分析，結果顯示其所編碼蛋白質的原子總數為5 068，蛋白質分子量為36.04 ku，理論等電點為7.66，不穩定系數值為 23.89，屬于穩定蛋白。該蛋白序列經預測不具有信號肽，無跨膜結構域。GAPDH蛋白質的亞細胞定位分析顯示該蛋白分布在細胞質中的可能性最大(69.6%)。該蛋白具有1個甘油醛-3-磷酸脫氫酶NAD結合域以及甘油醛-3-磷酸脫氫酶C末端結構域。用SWISS-MODEL在線分析對馬氏珠母貝GAPDH編碼蛋白的三級結構進行了建模預測，結果如圖3所示(模型為馬來絲蟲的GAPDH蛋白，SMTL id：4k9d.1)。

2.3 GAPDH基因序列比對與系統樹分析

用ClustalW1.83軟件將馬氏珠母貝GAPDH氨基酸序列與章魚(Octopusbimaculoides，XP_014786157.1)、 厚殼玉黍螺(Littorinalittorea，AJA37895.1)、泥鰍(Misgurnusanguillicaudatus，BAF43305.1)、紅鰭東方鲀(Takifugurubripes，NP_001267044.1)、孔雀魚(Poeciliareticulata，XP_008429670.1)、尼羅羅非魚(Oreochromisniloticus，XP_005455495.1)、尖吻鱸(Latescalcarifer，XP_018538252.1)、絲蟲(Loaloa，EJD75047.1)、布氏鼠耳蝠(Myotisbrandtii，XP_005873775.1)、橙腹草原田鼠(Microtusochrogaster，XP_005365298.1)、灰地鼠(Cricetulusgriseus，NP_001231783.1 )、密西西比短吻鱷(Alligatormississippiensis，XP_006258426.1)、中華鱉(Pelodiscussinensis，NP_001273856.1)、綠海龜(Cheloniamydas，ALU11325.1)、東部烏梢蛇(Thamnophissirtalis，XP_013923068.1)、新疆北鯢(Ranodonsibiricus，AMA21735.1)、眼斑雀鱔(Lepisosteusoculatus，XP_006642411.1)和小孢根霉(Rhizopusmicrosporus，CEG72784.1)的GAPDH氨基酸序列進行多重比較，發現共有177個氨基酸殘基位點為完全保守位點(圖4)。對上述物種的GAPDH進行系統發育樹的構建，發現馬氏珠母貝GAPDH蛋白首先與軟體動物門的厚殼玉黍螺(Littorinalittorea，AJA37895.1)進行聚類，然后與同是軟體動物門的章魚(Octopusbimaculoides，XP_014786157.1)進行聚類，進化樹親緣關系與動物分類學地位一致(圖5)。

2.4 去甲基化試劑處理受精卵中GAPDH表達檢測

熒光定量PCR檢測顯示，經去甲基化試劑5-氮雜胞苷溶液處理后，GAPDH基因在馬氏珠母貝受精卵中的表達水平上升，其表達量顯著高于對照組(滅菌海水處理)受精卵樣品中的表達量(P<0.05)(圖6)。

3 結論與討論

本研究通過RACE技術克隆獲得了馬氏珠母貝GAPDH基因cDNA全長序列(GenBank登錄號：KX129947.1)。該基因全長1 174 bp，其開放閱讀框長度為1 014 bp，編碼337個氨基酸，蛋白質分子量為36.04 ku，該蛋白具甘油醛-3-磷酸脫氫酶NAD結構域和甘油醛-3-磷酸脫氫酶C末端結構域。在糖酵解過程中，這2個結構域可結合3-磷酸甘油醛和NAD+，催化3-磷酸甘油醛轉變為1，3-二磷酸甘油酸，并以NAD+為受氫體生成NADH[3]。GAPDH蛋白的氨基酸序列在物種間保守性高，該研究比對物種中共有177個氨基酸殘基位點為完全保守位點。馬氏珠母貝GAPDH蛋白與同屬軟體動物門的厚殼玉黍螺和章魚的親緣關系相近，這與它們均為軟體動物的分類學地位一致。

定量檢測基因表達時，目的基因的表達量需與參考基因表達量進行標準化處理，GAPDH基因常被用作參考基因。如GAPDH基因在家蠅的不同發育時期及組織和不同飼養條件下表達穩定，可作為基因定量表達檢測的內參基因[9]。理想的內參基因應在各類型細胞、不同組織及不同處理條件下均表達量恒定，而研究發現大多常用的內參基因表達并不穩定，會影響到實時熒光定量PCR實驗的準確性[10-11]。GAPDH基因在嚴重敗血癥病人血液中的表達量較正常人中的表達量顯著升高[12]。利用3種軟件分析藍點馬鮫魚候選內參基因EF-1α、18S rRNA和GAPDH在不同組織中的表達穩定性，結果顯示GAPDH表達量是最不穩定的[13]。應用實時熒光定量PCR檢測了馬氏珠母貝GAPDH、β-肌動蛋白和18S rRNA共3個基因在不同組織、性腺發育時期、胚胎發育時期的表達水平。結果顯示，β-肌動蛋白表達量最穩定，18S核糖體RNA在性腺發育階段表達最穩定，而GAPDH基因在3個試驗組中均顯示為穩定性最差[14]。

基因核苷酸序列變異及其上的表觀遺傳修飾均可引起基因表達量的變化。筆者前期研究發現馬氏珠母貝外套膜基因組DNA甲基化水平與galectin基因的表達水平呈負相關，而galectin啟動子區甲基化水平與基因表達水平呈顯著正相關，DNA甲基化可能對galectin基因的表達具調控作用[15]。本研究中發現馬氏珠母貝受精卵經去甲基化試劑5-氮雜胞苷處理后，GAPDH基因表達水平較對照組顯著上升(P<0.05)。據此可推測，馬氏珠母貝GAPDH基因表達升高可能是去甲基化修飾所致，而其不適合作為內參基因的可能原因是不同條件下基因甲基化修飾變化所引起的基因表達水平變化。

本研究獲得了馬氏珠母貝GAPDH基因的全長cDNA序列，并利用去甲基化試劑(5-氮雜胞苷)處理受精卵，結果發現GAPDH基因表達量顯著升高。本研究結果為今后GAPDH基因的功能研究及表達調控機制分析提供了基礎及思路。

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