湖南本土牡丹遺傳多樣性與親緣關系的ISSR分析

鐘麗凡， 呂長平， 許文婷， 陳海霞

(湖南農業大學園藝園林學院，湖南長沙 410128)

牡丹(PaeoniasuffruticosaAndr.)為芍藥科(Paeniaceae)芍藥屬(PaeoniaL.)牡丹組(Sect.Moutan DC.)植物，是我國特有的植物種質資源[1-3]。我國牡丹品種多樣，觀賞牡丹分布地區以西北地區為主。湖南也是牡丹自然分布地區之一，其品種耐高溫高濕、抗病蟲害，但花色單一、花型簡單缺乏觀賞價值。因此，如何將觀賞牡丹與湖南牡丹的優良特性結合成為當前推廣湖南牡丹的首要任務。

目前牡丹育種工作主要以人工定向雜交選擇為主[4-5]。但現有湖南牡丹品種大多數親緣不清，對湖南具體牡丹品種數的統計比較籠統，存在育種工作效率低下、品種出新率低的問題。因此，研究清楚湖南本土牡丹種質資源親緣關系與遺傳多樣性對后續的選育工作至關重要。

簡單重復序列區間(inter-simple sequence repeat，簡稱ISSR)分子標記，由簡單重復序列(SSR)標記技術發展而來，ISSR分子標記結合了隨機擴增多態性DNA(randomly amplified polymorphic DNA，簡稱RAPD)的優點，同時克服了RAPD、SSR、限制性片段長度多態性(restriction fragment length polymorphism，簡稱RFLP)等技術的缺點[6-7]，具有高效、快速、穩定、易操作、成本低等優點，目前廣泛應用于親緣關系鑒定、種質資源遺傳多樣性分析等領域。本試驗采用ISSR分子標記技術對湖南本土牡丹親緣關系和遺傳多樣性進行研究，為選育優良牡丹品種提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

通過走訪湖南當地林業和農業部門、公司、企業、個體從業愛好者，對栽培時間長、來源不清的湖南牡丹種質資源進行調查。2014—2016年于開花期(3月下旬至4月上旬)、種子成熟期(7月下旬)、引種期(10月中下旬)在湖南牡丹的主要產地(邵陽、湘西、長沙)對資源識別、掛牌標記、形態特征、觀賞特性及生長情況進行調查，共收集了18份性狀穩定、植株平均年齡10年以上的湖南本土牡丹品種(表1)。采集牡丹新鮮嫩葉保存于-80 ℃冰箱。

1.2 DNA提取與檢測

采用筆者所在實驗室改良的十六烷基三甲基溴化銨(hexadecyl trimethyl ammonium bromide，簡稱CTAB)法進行提取，提取的樣品用紫外分光光度計檢測質量濃度，用1%瓊脂糖凝膠電泳粗略檢測樣品DNA的濃度與純度，最后稀釋標定為50 ng/μL，保存到-20 ℃冰箱備用。

1.3 ISSR-PCR優化反應體系和引物篩選

1.3.1 ISSR-PCR基本反應體系 通過多次重復驗證試驗，篩選出2×TransTaqHigh Fidelity PCR SuperMixⅠ(內含適量的Mg2+、dNTPs、TaqDNA聚合酶)作為總的反應環境。25 μL PCR反應體系：2×TransTaqHigh Fidelity PCR Super MixⅠ 12.5 μL、引物(10 μmol/L)1 μmol/L、模板(50 ng/μL)50 ng，最后加入ddH2O補足25 μL。

表1 18份牡丹品種及來源

1.3.2 ISSR-PCR優化反應體系 按照L9(33)正交試驗設計的方法[8-10]，進行體系總體積、模板濃度、瓊脂糖濃度的正交組合，每個處理重復3次(表2)，最終建立的最佳反應體系：20 μL反應總體積，模板濃度30 ng/μL，瓊脂糖濃度1.5%。然后在BIO-RAD PowerPac HV下以110 V的恒定電壓電泳30 min，最后用凝膠成像系統(BIO-RAD Gel DocTMXR+)拍照分析。

擴增反應在Applied Biosystems 9902 PCR儀上進行，PCR反應程序：95 ℃ 4 min；94 ℃ 45 s，50～60 ℃ 45 s，72 ℃ 1.50 min，共計35個循環；72 ℃延伸5 min，4 ℃保存[11]。

表2 ISSR-PCR反應體系的正交試驗

1.3.3 引物篩選 選用哥倫比亞大學(UBC)開發的ISSR 100個通用引物[12-13]，利用優化的反應體系進行引物篩選，引物由英濰捷基(上海)貿易有限公司合成；引物退火溫度參照相關研究[4，11-12]。最后從100條引物中篩選出11條條帶清晰、重復性好的引物。

1.4 圖譜分析

圖譜以0、1數據統計，在同一引物、同一位點根據條帶的有(1)、無(0)形成原始數據矩陣(0、1)矩陣[14-17]。利用PopGen32軟件計算多態位點比例(PPB)、Shannon’s信息指數、Nei’s基因多樣性指數等。用NTSYS2.10軟件計算遺傳相似系數和構建品種親緣關系。

2 結果與分析

2.1 牡丹DNA提取結果

牡丹基因組DNA經1%瓊脂糖凝膠電泳，每個點樣孔包括5 μL樣品DNA和1 μL 上樣緩沖液，各個條帶大小基本一致，基本無拖尾現象(圖1)。

2.2 ISSR-PCR體系篩選結果

反應體系(20 μL)如下：2×TransTaqHigh Fidelity PCR SuperMixⅠ 10 μL、DNA模板(30 ng/μL)1 μL、引物1 μL、ddH2O 8 μL。用1.5%瓊脂糖凝膠對擴增結果進行電泳。由圖2可以看出，條帶數量多且清晰可見，易于區分。

2.3 引物擴增結果

11條引物共擴增出162條條帶，多態性條帶133條，平均多態性比例82.6%。其中，引物UBC811擴增的條帶數最多，為22條，多態性比例86.4%(圖3、表3)。

2.4 18份牡丹品種遺傳多樣性分析

本試驗通過軟件PopGen32分析出供試牡丹品種的有效等位基因數(Ne)介于1.05～1.90之間，平均值為1.34[12-17]；Shannon’s信息指數(I)介于0.12～0.60之間，平均值為 0.34；Nei’s(1973)基因多樣性指數(H)介于0.05～0.40之間，平均值為0.22。

2.5 18份牡丹品種非加權組平均法(unweighted pair-group method with arithmetic means，簡稱UPGMA)聚類分析

用NTSYSpc2.1軟件構建全部材料UPGMA樹狀圖(圖4)，以相似系數0.733為閾值可將18份牡丹品種分為三大類。鳳丹白、鳳丹星、鳳丹紫、鳳丹、鳳丹粉被劃為第一大類，共5個品種，其中鳳丹白與鳳丹星的相似系數最近，說明它們的親緣關系最近。第二大類包括鳳丹綠、鳳丹玉、鳳丹綾、鳳丹舞、寶慶紅、寶慶粉共6個品種。第三大類包括楊山牡丹、永順粉、寧鄉紅、酈家香、紫繡球、湘繡球、湘紫斑。當相似系數值為0.74時，把18份牡丹品種分為4個類群，其中C8和C9單獨分為一類，由此說明鳳丹綠與鳳丹玉2個品種的遺傳背景與其他品種差異比較大。

表3 ISSR引物及其擴增產物的多態性水平

3 討論

本研究通過反復試驗挑選出混合了Mg2+、dNTPs、TaqDNA聚合酶在內的反應體系， 然后從總反應體積、 DNA模板濃度、瓊脂糖濃度3個方面進行結果篩選對比，最后挑選出了適合大部分引物擴增的最適反應體系，而且結果穩定，有效地節省了試驗時間，提高了試驗的精確度。

本試驗用篩選出的11條引物對18份湖南本土牡丹資源進行擴增，共擴增出164條條帶，多態性比例為81.1%，由此說明湖南本土牡丹資源豐富，品種間存在較豐富的遺傳變異，具有比較復雜的遺傳背景。

本研究中以NTSYS 2.1作為分析軟件，利用UPGMA法在閾值為0.74時將供試牡丹品種分為4個類群[18-20]，分析結果可以看出，基本品種都顯示出花色和花瓣復雜程度的優勢優先聚合在一起。第一類牡丹品種花色基本都是白色，只有鳳丹粉為粉色，鳳丹紫為紫色，初步分析這2個品種可能是鳳丹白與非白色系牡丹品種的雜交后代表現出的親本性狀。第二類2個品種花型偏小，植株比較低矮，所以從聚狀圖上可看出這2個品種單獨聚為一類，說明形態學鑒定與分子標記技術具有一定的關聯性，表明這2個品種的遺傳性狀相比其他品種差異比較大。第三類中鳳丹綾與鳳丹舞都為白色花，鳳丹綾的花瓣頂部羽狀淺裂，鳳丹舞的花瓣頂部鋸齒狀淺裂，花型都為單瓣型，相似系數比較大，說明親緣關系比較近。寶慶紅與寶慶粉2個品種在形態學性狀上基本相似，且在分子標記學上表明它們的親緣關系很近。第四類幾乎所有的品種花色都比較艷麗，寧鄉紅與酈家香的相似系數最接近，說明它們的遺傳背景相似；紫繡球與湘繡球花型都為球花臺閣型，花色比較接近，根據聚狀圖的分析，它們的親緣關系比較接近，而湘紫斑的相似系數最小，說明它們的親緣關系最遠。從來源地分析，表明同一地域品種相似度比較高，而且基本是2個形狀非常相似的品種聚合在一起，推測是由于近距離的異花授粉而出現的性狀分離的雜交后代。

目前，牡丹新品種選育基本依賴于傳統的人工雜交方法，耗時長，基本每3年才能進行選育；選擇親本的過程比較盲目，而湖南有豐富的牡丹種質資源，牡丹品種具有耐高溫、高濕、抗病蟲害的優良性狀，充分了解湖南本土牡丹品種的遺傳多樣性與親緣關系將有助于提高選育的效率與質量，從而為觀賞牡丹與湖南本土油用牡丹的雜交提供便利，為牡丹在南方市場的推廣打下基礎。

參考文獻：

[1]洪德元，潘開玉. 牡丹芍藥分會：推動牡丹深加工[J]. 中國花卉園藝，2015(5)：27.

[2]洪 濤，張家勛，李嘉玨，等. 中國野生牡丹研究(一)芍藥屬牡丹組新分類群[J]. 植物研究，1992，12(3)：223-234.

[3]楊淑達，施蘇華，龔 洵，等. 滇牡丹遺傳多樣性的ISSR分析[J]. 生物多樣性，2005，13(2)：105-111.

[4]石顏通，周 波，張秀新，等. 牡丹89個不同種源品種遺傳多樣性和親緣關系分析[J]. 園藝學報，2012，39(12)：2499-2506.

[5]周 波，江海東，張秀新，等. 部分引進牡丹品種的形態多樣性[J]. 生物多樣性，2011，19(5)：543-550.

[6]陳濤林，王漢超，羅軍武，等. 汝城白毛茶種質資源遺傳多樣性和親緣關系的ISSR分析[J]. 分子植物育種，2017，15(9)：3780-3787.

[7]劉 彤，葛智文，陳濤林，等. 柳州九萬山野生茶樹種質資源遺傳多樣性的ISSR分析[J]. 南方農業學報，2015，46(11)：1943-1948.

[8]麻 揚，白學良，趙東平. 山羽蘚ISSR-PCR反應體系優化及引物篩選[J/OL]. 分子植物育種，2017-09-27[2017-11-10]. http：//kns.cnki.net/kcms/detail/46.1068.S.20170927.1711.016.html.

[9]任秀霞，張 盈，薛璟祺，等. 滇牡丹天然居群的遺傳多樣性分析[J]. 植物遺傳資源學報，2015，16(4)：772-780.

[10]趙孟良，孫雪梅，王麗慧，等. 43份菊芋種質資源遺傳多樣性的ISSR分析[J]. 西北農林科技大學學報(自然科學版)，2015，43(9)：150-156，177.

[11]張旻桓，金曉玲，成仿云，等. 湖南產牡丹遺傳多樣性的ISSR分析[J]. 中草藥，2016，47(7)：1193-1198.

[12]楊美玲，唐 紅. 紫斑牡丹遺傳多樣性的ISSR分析[J]. 西北植物學報，2012，32 (4)：693-697.

[13]高昊丹. 芍藥屬植物的綜合評價及其親緣關系的研究[D]. 沈陽：沈陽農業大學，2012.

[14]童 芬，謝登峰，曾心美，等. 四川牡丹和圓裂四川牡丹遺傳多樣性的ISSR分析[J]. 西北植物學報，2016，36(10)：1968-1976.

[15]楊美玲. 紫斑牡丹遺傳多樣性的ISSR分析[D]. 蘭州：甘肅農業大學，2012.

[16]蔡 健，李 浩，趙 翔，等. 22個牡丹品種形態性狀的多樣性分析[J]. 安徽農業科學，2015，43(35)：57-59.

[17]孫嘉磊，楊志剛，羅 兵，等. 21個日本牡丹品種DNA指紋圖譜構建與EST-SSR標記遺傳多樣性分析[J]. 江蘇農業科學，2015，43(9)：50-53.

[18]宋倩倩，付茂旺，何藝凡，等. 福建省浙江紅花油茶遺傳多樣性的ISSR分析[J]. 四川農業大學學報，2017，35(3)：370-374.

[19]李 昂，葛 頌. 植物保護遺傳學研究進展[J]. 生物多樣性，2002，10(1)：61-71.

[20]武玉珍，馮睿芝，張 峰. 基于ISSR分子標記的褐馬雞親緣關系分析[J]. 生態學報，2015，35(4)：1059-1067.