芒果LAR基因的克隆及其表達分析

趙志常， 高愛平， 黃建峰， 羅睿雄， 劉寬亮

(1.中國熱帶農業科學院熱帶作物品種資源研究所/農業部華南作物基因資源與種質創制重點開發實驗室，海南儋州 571737；2.國家熱帶果樹品種改良中心，海南儋州 571737； 3.海南大學農學院，海南海口 570228)

無色花青素還原酶(leucoanthocyantin reductase，簡稱LAR)催化黃烷3，4二醇轉化為2，3-反式黃烷三醇，比如生成兒茶素、沒食子兒茶素等[1-2]。目前已從擬南芥、茶樹、苜蓿、甘肅紅豆草、黑枸杞、百脈根等多種植物中克隆得到LAR基因[3-9]。LAR是由花青素還原酶(anthocyanidin reductase，簡稱ANR)經過MYB轉錄因子家族共同調控的，對其酶活性的檢測也有相關的報道，如在蒺藜苜蓿中編碼LAR的基因已經鑒定，并進行了重組LAR經體外純化后的活性檢測，而與金錢草的葉子純化過的酶活相比非常低；也有研究表明，不能檢測到蓮屬植物中重組LAR的任何活性，除非體系中只有單一蛋白且用無色花青素作底物時，可以檢測到LAR的微弱活性[2]。芒果(Mangiferaindica)是重要的熱帶、亞熱帶果樹，其果實色彩多樣，如綠色、黃色、淺黃色、紅色、橙紅色等[10]。芒果果實中含有黃酮類、類胡蘿卜素和花青素等物質。芒果果實的LAR基因的研究工作未見報道，本研究采用RACE方法從芒果的果實中克隆得到1個LAR基因，深入探討該基因在芒果果實原花色素合成的作用機制及其對果實果皮的影響，借以深入揭示該基因在芒果果實作用的分子機制，為芒果果實生產提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

在貴妃芒果完全成熟變黃時，用刀片取其果皮，切碎放入采樣袋中用液氮速凍后立即放入-80 ℃冰箱內保存備用。

1.2 試驗方法

1.2.1 果皮總RNA提取 采用植物RNA提取試劑盒，用DNase試劑盒進行基因組DNA消除，RNase-free無菌水溶解，采用SMARTerTMRACE Amplification Kit(Clontech)反轉錄合成cDNA。

1.2.2 PCR擴增 反應條件為94 ℃預變性4 min；94 ℃變性50 s，50 ℃退火50 s，72 ℃延伸2 min，35個循環；72 ℃繼續延伸7 min。反應體系為25 μL，其中含10×PCR buffer(含Mg2+)2.5 μL、25 ng DNA模板、20 μmol引物、1.0 UTaqDNA聚合酶、5.0 mmol dNTPs。

1.3 LAR基因全長cDNA序列的獲得

以合成的cDNA為模板，根據已知的LAR基因片段設計cDNA 3′ RACE和5′RACE引物，進行3′和5′端的擴增。將目的基因片段回收、連接、轉化、鑒定及測序，并根據得到的cDNA 3′ 端和5′末端的序列結果拼接LAR的全長cDNA，設計特異引物，進行全長cDNA序列的擴增。

1.4 LAR基因生物信息學分析

根據Blast(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Blast)登錄的LAR蛋白序列進行氨基酸序列的同源性分析，用DNAMAN軟件進行序列多重比對，并繪制系統進化樹推斷其在進化過程中的親緣關系。采用Bioedit軟件對LAR蛋白中各個氨基酸的含量、親水/疏水性進行分析。采用WoLFPSORT(http：//www.genscript.com/wolf-psort.html)軟件進行定位預測，采用Swissmodel(http：//swissmodel.expasy.org/)進行蛋白的三級結構預測。

1.5 表達分析

分別提取3種不同色澤芒果的RNA，反轉為cDNA并采用primer 5.0設計引物進行反轉錄PCR(reverse transcription-PCR，簡稱RT-PCR)的擴增。RT-PCR分析采用的內參引物序列為actin-F 5′-AATGGAACTGGAAT GGTCAAGGC-3′，actin-R 5′-TGCCAGATCTTCTCCATG TCATCCCA-3′；目的基因擴增采用的引物為：LAR-F，5′-TCG GTCATTTTGTAGCCGAC-3′，LAR-R 5′-ATACAATG GAGCAACGTAACTA T-3′，PCR 產物在1.0%的瓊脂糖凝膠上進行電泳，并采用Quantity One軟件進行數據分析，作出相對表達量。

2 結果與分析

2.1 LAR基因的獲得

根據得到的3′端和5′端序列信息進行拼接，最后得到LAR基因的全長cDNA序列。根據拼接序列設計特異性引物進行全長cDNA序列的擴增，電泳條帶回收測序后得到LAR基因的cDNA全長序列為1 221 bp，分析發現開放閱讀框為 1 059 bp，編碼352個氨基酸序列，通過NCBI上已經登錄的茶樹、草莓、大豆的LAR蛋白序列進行了比對(圖1)發現，克隆的基因為芒果LAR基因。

2.2 芒果LAR基因的部分生物信息學分析

采用Bioedit軟件對芒果LAR蛋白中各個氨基酸的含量進行分析發現，該蛋白天冬酰胺的含量較高，而其他的氨基酸含量相對比較低(圖2)，對其蛋白二級結構進行預測發現，芒果LAR蛋白的二級結構主要以無規則卷曲和β-折疊為主，也具有少量的α-螺旋結構(圖3)。采用Bioedit軟件的Kyte和Doolittle算法對LAR蛋白的親水/疏水性(正值表示疏水性，負值表示親水性)進行分析，LAR蛋白所含的氨基酸主要介于1.8～-2.4之間(圖4)。采用WoLFPSORT(http：//www.genscript.com/wolf-psort.html)軟件對LAR蛋白進行定位預測發現，該基因定位在細胞質中，采用Swissmodel(http：//swissmodel.expasy.org/)在線軟件對蛋白的三級結構進行預測，推導出該蛋白可能的三級結構構型(圖5)。采用DNAMAN軟件進行親緣關系聚類分析發現，芒果LAR蛋白與棉花、葡萄、藍莓、柿等植物的蛋白序列聚為一類(圖6)。

2.3 LAR基因的RT-PCR分析

提取3種不同顏色的芒果品種果皮的RNA，反轉錄為cDNA，通過上述RT-PCR分析的引物進行擴增，對擴增結果進行分析發現，該基因在綠色桂七品種的果實中表達較多，在紅色果皮的貴妃品種中表達次之，而黃色果皮的金煌品種中相對表達較少(圖7)。

3 討論

在果樹的果實中其次生代謝物合成與積累量取決于其合成途徑中一些關鍵酶的功能和含量，這些關鍵酶一般位于代謝支路分叉口或途徑的下游。芒果無色花青素還原酶(LAR)基因的克隆與分析有助于解析芒果果皮中兒茶素合成和積累的機制。聚類分析結果發現，芒果LAR蛋白與棉花、葡萄、藍莓、柿等可以聚為一類，說明在這些植物中LAR蛋白具有一定的相近關系，而生長在溫帶的蘋果、西洋梨、甜櫻桃、海棠、草莓等植物聚在一類，可見，LAR蛋白序列在不種植物間的差異符合一些植物學分類學的特征，在一定程度上反映不同果樹植物在進化過程中對溫度的需求關系。對LAR基因的表達分析發現，在綠色果實品種中表達量較高，而在黃色品種中表達量較低，這可能與果實中原花色素、黃酮類物質的含量有一定的關系。有研究報道，在紅豆草中LAR基因的表達在不同組織中有一定的差異，其中在葉片中的表達量最高，其次是花和果實，在莖稈中表達量最低[6]；在毛白楊中的表達[11]與此一致。Bogs等對LAR基因在葡萄中的表達進行研究發現，在葉子、花、果實中均有表達，且隨著葉子、花、果實的生長，原花色素不斷增加，在成熟的果實中表達LAR基因表達量較少，原花色素也不再增加[12]。本研究發現，LAR基因在綠色桂七芒果品種中表達較高，而在黃色的金煌品種中表達量較低，這與果皮中原花色素的含量表現得一致。故推測，LAR基因表達在原花青素途徑中具有重要的作用。芒果LAR基因是芒果原花色素合成代謝途徑中的一個關鍵基因，其對芒果果皮色澤的影響具有重要作用，而其對芒果果實色澤功能的影響須要進一步轉基因植物表達的驗證。

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