少孢節叢孢菌幾丁質酶AO-801基因的分子特征分析及其多克隆抗體制備

貢莎莎， 孟慶玲， 喬 軍， 鐘文強， 陳 英， 才學鵬

(1.石河子大學動物科技學院，新疆石河子 832003； 2.中國農業科學院蘭州獸醫研究所，甘肅蘭州 730046)

現有的研究發現，捕食線蟲性真菌——少孢節叢孢菌產生的侵染性胞外蛋白酶在其侵染線蟲時能夠發揮重要作用[1-5]。然而，以往的研究多集中在探討捕食線蟲性真菌胞外酶絲氨酸蛋白酶的機制和功能上，鮮有對捕食線蟲性真菌少孢節叢孢菌的幾丁質酶的相關報道。Yang等已經從少孢節叢孢菌(Arthrobotrysoligospora)全基因組中鑒定出16個開放閱讀框(ORF)編碼假定的幾丁質酶[5]，對其進行功能結構域、分子量和轉錄分析表明，大多數幾丁質酶在碳源缺乏、含有幾丁質底物或植物病原真菌時表達量上調，提示少孢節叢孢菌幾丁質酶可能發揮重要作用。

少孢節叢孢菌是目前研究最多的一種捕食線蟲性真菌，在自然界中廣泛分布[2]。2011年，Yang等首次對捕食線蟲性真菌——少孢節叢孢菌進行了全基因組測序[4]，對基因組編碼的侵染性胞外蛋白酶進行了生物信息學分析，共發現和鑒定出16個幾丁質酶，然而這些幾丁質酶的生物學功能尚未被深入研究。為了研究少孢節叢孢菌在侵染線蟲中高表達的幾丁質酶AO-801的生物學功能，本研究對少孢節叢孢菌 XJ-A1 幾丁質酶AO-801基因進行克隆，并在大腸桿菌BL21(DE3)中進行誘導表達，擬純化獲得重組AO-801蛋白酶，制備高效價的多克隆抗體，為研究少孢節叢孢菌中該蛋白酶作用的分子機制奠定前期基礎。

1 材料與方法

1.1 菌株及試劑

捕食線蟲性真菌少孢節叢孢菌新疆分離株XJ-A1、EscherichiacoliDH5α菌株、EscherichiacoliBL21(DE3)菌株和表達載體pET32a，由石河子大學動物科技學院實驗室保存。2×TaqPCR Master Mix、透析袋，購自廣州東盛生物科技有限公司。PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒、pMD19-T載體、組氨酸標簽(His-tag)融合蛋白純化柱(SinoBio)，購自TaKaRa公司。EZ Spin Column Fungal RNA Isolation Kits試劑盒，購自生工生物工程(上海)股份有限公司。鼠抗His抗體、辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗鼠IgG，購自北京全氏金生物技術有限公司。Soluble TMB Substrate Solution，購自天根生化科技(北京)有限公司。T4DNA連接酶，購自Promega公司。。

1.2 幾丁質酶AO-801引物的設計

根據GenBank中登錄的AO-801基因序列，用Primer 5軟件設計合成1對特異引物，上、下游引物分別引入EcoR Ⅰ、XhoⅠ限制性內切酶位點，上游引物：5′- CCGGAATTC ATGAAGGCCATCTATGGACGTAACT-3′(下劃線部分為EcoRⅠ酶切位點)，下游引物：5′-CCGCTCGAGTCA AGCGCAAGCGCTGCG-3′(下劃線部分為XhoⅠ酶切位點)。引物由北京六合華大基因科技股份有限公司合成。

1.3 幾丁質酶AO-801基因的擴增與克隆

將少孢節叢孢菌XJ-A1分離株接種于YPSSA培養基上，于20 ℃霉菌培養箱內培養1周。取適量菌絲，用TaKaRa真菌RNA提取試劑盒提取XJ-A1分離株RNA，用RT試劑盒反轉錄成cDNA，進行逆轉錄PCR(RT-PCR)擴增。20 μL PCR反應體系：9 μL H2O2，8 μL PCR Mixture，各0.5 μL上下游引物，2 μL提取的cDNA模板。AO-801基因擴增反應條件：95 ℃ 5 min；94 ℃ 50 s，65 ℃ 40 s，72 ℃ 120 s，35個循環；72 ℃ 10 min。擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳分離，切膠回收。將回收的AO-801基因片段與pMD19-T載體連接后轉化至E.coliDH5α感受態細胞，經氨芐青霉素抗性平板篩選及菌液PCR驗證后，送至北京六合華大基因科技股份有限公司測序。

1.4 幾丁質酶AO-801分子特征分析

將測序結果與少孢節叢孢菌標準株[美國模式培養物集存庫(American type culture collection，簡稱ATCC) 24927]的幾丁質酶AO-801進行比對分析，并利用生物在線分析軟件(http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/，http：//www.ebi.ac.uk/interpro/，http：//www.expasy.org/tools/，SMART，Prabi，SWISS-MODEL等)進行相關生物信息學分析。

1.5 原核表達質粒pET-AO801的構建

用EcoR Ⅰ和XhoⅠ分別對pMD19-T-AO801和pET32a質粒進行雙酶切，回收pET32a載體片段和AO-801目的片段，在T4DNA連接酶作用下，于4 ℃過夜連接后轉化入E.coliDH5α感受態細胞中，在氨芐抗性平板上于37 ℃過夜培養，挑取單菌落，再經菌液PCR和雙酶切方法篩選陽性克隆(命名為pET-AO801)。

1.6 目的蛋白的誘導表達及SDS-PAGE和Western Blot分析鑒定

將重組質粒pET-AO801轉化入E.coliBL21(DE3)感受態細胞中，挑取陽性克隆于含氨芐抗性的5 mL液體LB培養基中，37 ℃、180 r/min過夜培養，再取3mL菌液接種于 200 mL 液體LB培養基中，培養至D600 nm約為0.6～0.8，加入終濃度為1 mmol/L的誘導劑異丙基硫代半乳糖苷(isopropylβ-D-thiogalactoside，簡稱IPTG)，進行誘導表達。誘導6 h后收集菌體，對重組菌的表達產物進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，簡稱SDS-PAGE)和蛋白質印跡法(Western Blot)分析。

1.7 重組幾丁質酶AO-801的純化及多克隆抗體制備

誘導6 h后于8 000 r/min離心10 min，收集菌體，加 15 mL 裂解液(lysis buffer)裂解菌體，用鎳柱親和層析法純化重組蛋白。將純化的重組蛋白與等體積的弗氏完全佐劑混勻后按 0.2 mL/只的劑量皮下注射接種給小鼠，14、21 d后再將純化的蛋白與弗氏不完全佐劑混勻并注射小鼠，采血分離血清。

1.8 重組幾丁質酶AO-801多克隆抗體效價的測定

用包被緩沖液將純化的重組蛋白稀釋為10 μg/mL，酶標板各加入100 μL/孔，4 ℃過夜。扣干，加入300 μL/孔洗滌緩沖液洗3次；用150 μL/孔封閉液于37 ℃封閉1 h；洗滌3次后，加入不同稀釋度的血清，100 μL/孔，37 ℃孵育2h，洗滌清洗5次，每孔加入100 μL辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG(1 ∶2 000)溶液，37 ℃孵育1 h。洗滌緩沖液清洗5次后，加入100 μL/孔TMB顯色液，37 ℃避光反應30 min，加入 100 μL/孔 2 mol/L硫酸終止反應。用酶標儀測定450 nm處的吸光度。

2 結果與分析

2.1 RT-PCR擴增結果

以少孢節叢孢菌的cDNA為模板，通過RT-PCR擴增、瓊脂糖凝膠電泳分析，結果表明，PCR擴增產物大小約為1 100 bp，與GenBank中提供的AO-801基因片段大小一致(圖1)。

2.2 測序結果及序列分析

經測序，AO-801基因全長1 448 bp，有3個內含子序列，分別位于第139～204、442～513和1 183～1 361位核苷酸，內含子具有保守的5′-GT、3′-AG末端，符合真菌內含子特征；有1個1 131 bp的開放閱讀框(ORF)，編碼376個氨基酸，無信號肽序列(圖2)；與少孢節叢孢菌標準株(ATCC 24927)的幾丁質酶基因AO-801核苷酸序列的同源性為95.96%，氨基酸序列的同源性為97.34%。Scanprosite軟件分析發現，該幾丁質酶屬于糖苷水解酶18家族，其特征序列為第120～128位氨基酸的LDGVDVDWE；有2個高度保守的區域SIGGW、LDGVDVDWE，SIGGW位于第82～86位氨基酸，為底物結合位點，LDGVDVDWE位于第120～128位氨基酸，為水解酶催化活性位點。

經過SMART在線分析，AO-801編碼的蛋白具有1個Glyco-18結構域，位于第3～333位氨基酸；Interpro軟件預測結果顯示，幾丁質酶AO-801存在1個幾丁質酶插入域，位于第243～304位氨基酸位置(圖3)。SWISS-MODEL軟件的三級結構預測結果(圖4)顯示，幾丁質酶AO-801具有(α/β)8的三磷酸異構酶(triosephosphate isomerase，簡稱TIM)桶形結構域(簡稱TIM桶)，與煙曲霉YJ-407的幾丁質酶結構相似。

2.3 重組質粒pET-AO801的雙酶切鑒定

重組質粒pET-AO801經PCR和雙酶切鑒定， 得到大小約為1.1 kb的插入片段，與預期一致(圖5)。測序結果表明，插入片段大小為1 131 bp，為目的基因片段，表明開放閱讀框正確。

2.4 重組蛋白AO-801的誘導表達、純化及SDS-PAGE和Western-Blot分析

陽性菌落經1 mmol/L IPTG誘導6 h后提取蛋白，表達產物經SDS-PAGE分析(圖6)后，在相對分子質量約為59 ku處可見特異性反應條帶，分子量與預期值相同。利用鎳柱純化技術純化重組蛋白酶，經SDS-PAGE分析，得到單一條帶，且與預期大小一致。Western Blot分析(圖7)表明， 表達的重組蛋白酶能與少孢節叢孢菌陽性血清發生特異性血清學反應。

2.5 間接酶聯免疫吸附測定(enzyme linked immunosorbent assay，簡稱ELISA)檢測多克隆抗體

用間接ELISA測定抗AO-801多克隆抗體效價。將抗血清稀釋至不同濃度(1 ∶200～1 ∶25 600)，檢測結果顯示，多克隆抗體效價達到1 ∶25 600(圖8)。

3 討論

目前國內外已有報道表明，少孢節叢孢菌在侵染線蟲過程中分泌的胞外水解酶(蛋白酶、膠原酶和幾丁質酶)在侵入線蟲表皮和降解線蟲細胞的過程中發揮著重要作用[2-4]。幾丁質是由N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖以β-1，4糖苷鍵連接而成的鏈狀高分子化合物，是含量僅次于纖維素的第二大生物高聚物，也是大多數線蟲體壁及其蟲卵外殼的主要成分[5]。已有研究表明，許多真菌在其整個生長過程中都會產生幾丁質酶，源于致病性真菌的幾丁質酶能催化幾丁質β-1，4糖苷鍵水解，對真菌侵入線蟲表皮屏障并進一步降解宿主細胞有重要的作用[1，3-5]。

1989年Dackman等在捕食線蟲性真菌培養液中檢測到幾丁質酶活性，并發現幾丁質酶的活力水平與致病性密切相關[6]。近年來，Taib等在煙曲霉中發現了14個幾丁質酶[7]，且煙曲霉YJ-407幾丁質酶的晶體結構已有初步研究[8]。此外，Dünkler等在白色念珠菌中發現4個幾丁質酶[9]，在絲狀真菌構巢曲霉中發現了18個幾丁質酶，在綠僵菌中發現了24個幾丁質酶[10]，越來越多的有功能的幾丁質酶不斷在細菌、病毒、真菌、植物以及動物等不同生物上被發現。

本研究中對少孢節叢孢菌新疆分離株XJ-A1幾丁質酶基因AO-801進行了克隆和分子特征分析，發現AO-801酶屬于糖苷水解酶18家族，也具有類似的結構域，含有幾丁質底物結合位點、水解酶催化活性位點[11-14]，同時還發現1個幾丁質酶插入域(chitinase insertion domain，簡稱CID)。許多GH18中的幾丁質酶含有CID，通常CID由5個或5個反平行β-折疊和1個α-螺旋組成，并且其插入TIM桶的第7個α-螺旋和第7個β-折疊之間[15]。CID與TIM桶能夠使幾丁質酶和底物牢固結合，從而更有利于底物的降解。Li等將來自古細菌、細菌、真菌、植物和動物的共27個含有幾丁質酶插入域的幾丁質酶序列進行比對和分析，確定了1組高度保守的疏水殘基對幾丁質酶的折疊和結構穩定性很重要，并推測TIM桶結構域+CID可以通過提供深的底物結合裂縫來結合長鏈底物，但是關于CID在幾丁質酶發揮功能中的作用尚未完全確定[16]。少孢節叢孢菌幾丁質酶AO-801存在的TIM桶結構域和CID可能預示其能更好地與底物結合，可能在真菌捕食線蟲的過程中發揮重要作用。此外，Arakane等發現，高度糖基化的接頭可以保護幾丁質酶免于發生蛋白水解，而在AO-801中并未發現存在糖基化位點[17]。

真菌在其整個生長過程中能產生多種幾丁質酶，不同真菌幾丁質酶的生物學功能及其在致病過程發揮的作用也存在差異[18-19]。Arnold等報道的GH18可能參與線蟲的蛻皮以及幼蟲孵化等過程[20-21]。Khan等將擬青霉菌的幾丁質酶作用于爪哇根結線蟲蟲卵，發現幾丁質酶顯著改變了卵殼結構，并且卵黃層被分裂并失去其完整性[22]。少孢節叢孢菌是新疆地區分布廣泛的捕食線蟲性真菌，通過對捕食線蟲性真菌胞外水解酶——幾丁質酶功能的深入研究將有助于開發適合新疆地區的線蟲防控真菌制劑。

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