雌激素受體α、β及基質金屬蛋白酶-9在人甲狀腺乳頭狀癌中的表達及意義

陳素琴，袁海洪，馮立新

(天津市武清區人民醫院病理科，天津 301700)

甲狀腺腫瘤占所有腫瘤的1%，其中大部分為內分泌惡性腫瘤[1]，并且其發生率在近幾年快速增加[2]，尤其是甲狀腺乳頭狀癌(PTC)[1]。PTC的男女發病率之比為1∶4，提示雌激素在PTC的發生發展中可能具有重要作用，雌激素經典的信號通路是由兩個細胞內受體介導的，即雌激素受體α(ERα)和雌激素受體β(ERβ)。而基質金屬蛋白酶-9(MMP-9)的表達異常與人類惡性腫瘤的浸潤與轉移密切相關[3]。為了研究ERα、ERβ對人類PTC中癌細胞的遷移和侵襲的影響，我們采用免疫組織化學(免疫組化)法檢測ERα、ERβ和MMP-9在200例PTC組織和100例結節性甲狀腺腫(NTG)中的表達，探討三者與PTC臨床病理特征之間的關系。

1 資料與方法

1.1一般資料收集2003年6月至2016年7月間天津市武清區人民醫院病理科常規外檢的200例PTC和100例NTG患者切除的組織包埋塊。其中PTC患者中男性47例，女性153例；年齡范圍25～60歲，中位年齡45歲；腫瘤≥2 cm者86例，<2 cm者114例；有包膜侵犯者107例，無包膜侵犯者93例；有淋巴結轉移者79例，無淋巴結轉移者121例；根據TNM分期：Ⅰ～Ⅱ期134例，Ⅲ～Ⅳ期66例。所有病例在腫瘤切除前均未進行放療和化療。所有病例均經兩位副主任醫師以上病理醫師閱片明確診斷為PTC和NTG。

本研究經天津市武清區人民醫院醫學倫理委員會批準，患者及其近親屬知情同意。

1.2研究方法免疫組化Elivision兩步法 將準備好的石蠟組織塊，切成石蠟切片，置于67 ℃烘箱中，烘片2 h，脫蠟至水，用pH 7.4的PBS沖洗3次，每次3 min。取一定量pH 6.0檸檬酸鹽緩沖液，加入微波盒中，微波加熱至沸騰，將脫蠟水化后的組織切片置于耐高溫塑料切片架上，放入已沸騰的緩沖液中，中檔微波處理10 min，取出微波盒流水自然泠卻，從緩沖液中取出玻片，先用蒸餾水沖洗兩次，之后用PBS沖洗2次，每次3 min。每張切片加1滴3%雙氧水，室溫下孵育10 min，以阻斷內源性過氧化物酶的活性。PBS沖洗3次，每次3 min。除去PBS液，每張切片加1滴相應的第一抗體，室溫下孵育2 h。PBS沖洗3次，每次5 min。除去PBS液，每張切片加1滴聚合物增強劑(試劑A)，室溫下孵育20 min。PBS沖洗3次，每次3 min。除去PBS液，每張切片加1滴酶標抗鼠/兔聚合物(試劑B)，室溫下孵育30 min。PBS沖洗3次，每次5 min。除去PBS液，每張切片加1滴新鮮配制的DAB液，顯微鏡下觀察5 min。蘇木素復染，0.1%鹽酸分化，自來水沖洗，藍化，切片經梯度酒精脫水干燥，二甲苯透明，中性樹膠封固，晾干后觀察。

1.3材料與試劑單克隆兔抗人ERα抗體為abcam公司產品，工作液濃度為1∶100；單克隆兔抗人ERβ抗體為abcam公司產品，工作液濃度為1∶200；單克隆兔抗人MMP-9抗體為abcam公司產品，工作液濃度為1∶200。即用型第二代免疫組化Elivision plus廣譜試劑盒，購自福州邁新生物技術開發有限公司。操作嚴格按照試劑盒說明書進行，用已知陽性切片做陽性對照，以PBS代替一抗作陰性對照。

1.4結果判定ERα蛋白主要表達于細胞核，ERβ蛋白主要表達于細胞核和細胞質，MMP-9主要表達于細胞質和細胞膜，以出現棕黃色顆粒染色為陽性。根據細胞染色強度和染色細胞所占面積兩者積分之和對組織切片中各點評分。染色強度定性積分：不著色為0，淺黃色為1，棕黃色為2，棕褐色為3；染色面積定量積分：無著色或<5%為0，5%～<24%為1，25%～<50%為2，≥50%為3；兩種積分相加為該點得分。兩項得分相加為總積分，依照0為-，1～2為+，3～4為++，5～6為+++，進行半定量判斷；>2(++和+++)為陽性，≤2(-和+)為陰性進行定性判斷。

1.5統計學方法應用SPSS 19.0統計軟件包進行數據分析。計數資料用例(%)表示，組間比較采用χ2檢驗。采用Spearman等級相關分析進行相關性研究。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1ERα、ERβ和MMP-9在PTC組織及NTG組織中的表達ERα陽性著色位于細胞核(圖1)，ERβ陽性著色位于細胞核和細胞質(圖2)，MMP9陽性著色位于細胞質和細胞膜(圖3)。

在PTC及NTG組織中，ERα的陽性表達率分別為56.00%(112/200)和8.00%(8/100)，其差異有統計學意義(P<0.01)；ERβ的陽性表達率分別為70.00%(140/200)和 58.00%(58/100)，其差異有統計學意義(P<0.01)；MMP-9的陽性表達率分別為82.00%(164/200)和65.00%(65/100)，其差異有統計學意義(P<0.01)。見表1。

表1 PTC和NTG組織中ERα、ERβ和MMP-9的陽性表達率的比較/例(%)

注：ERα為雌激素受體α、ERβ為雌激素受體β、MMP-9為基質金屬蛋白酶-9、PTC為人甲狀腺乳頭狀癌、NTG為結節性甲狀腺腫

2.2在PTC中ERα、ERβ和MMP-9的表達與臨床病理特征間的關系在PTC中，ERα蛋白的陽性表達率與患者的性別有關，其在女性患者中的表達明顯高于男性患者(P<0.01)。MMP-9的陽性表達率與腫瘤的包膜侵犯有關，在已侵犯腫瘤包膜的腫瘤中的表達高于無包膜侵犯的腫瘤(P<0.01)。MMP-9的陽性表達率與是否有淋巴結轉移有關，在有淋巴結轉移組中的表達陽性率高于無淋巴結轉移組 (P<0.05)。MMP-9的陽性表達率還與TNM分期有關，隨著TNM分期的進展呈上升趨勢，在Ⅰ和Ⅱ期中的表達陽性率低于Ⅲ和Ⅳ期(P<0.05)。ERα蛋白的陽性表達率與腫瘤大小、包膜侵犯、淋巴結轉移及TNM分期無關(P>0.05)。ERβ蛋白的陽性表達率與患者性別、腫瘤大小、包膜侵犯、淋巴結轉移及TNM分期無關(P>0.05)。MMP9的陽性表達率與患者性別和腫瘤大小無關(P>0.05)。見表2。

2.3在PTC中ERα、ERβ和MMP-9之間的相關關系Spearman等級相關分析顯示，在PTC組織中，ERα蛋白的陽性表達率和MMP-9蛋白的陽性表達率呈正相關關系(r=0.573，P<0.01)，ERβ蛋白的陽性表達率和MMP-9蛋白的陽性表達率呈負相關關系(r=-0.520，P<0.01)。

3 討論

雌激素受體在甲狀腺組織中的表達首次報道于1981年，Molteni等[4]通過使用符號定向圖(SDG)法證實甲狀腺乳頭狀癌組織中有雌激素受體表達。目前國內外研究對于PTC和NTG組織中ERα和ERβ的表達仍有爭議，有大量的證據表明PTC和NTG組織中存在ERα和ERβ的表達，但仍有個別研究在PTC和NTG中未檢測到ERα和ERβ的表達[5]。

這種爭議可能是因為雌激素受體的亞細胞定位判斷的不同引起的，另外則是采用不同的實驗方法、技術及統計方法等因素造成的。本研究中運用免疫組化的方法，結果顯示在PTC和NTG中，ERα表達于細胞核，而ERβ則表達于細胞核和細胞質中。

有研究顯示ERα與ERβ對細胞的生存和增殖有相反的作用，ERα具有促進細胞增殖和抑制細胞凋亡的作用，而ERβ卻顯示了在分化和促進細胞凋亡中的作用[6]。本研究中ERα在PTC中的表達遠遠高于其在NTG中的表達，與 Chen等[6]研究一致。這進一步表明在PTC中，ERα是一個重要的細胞增殖指標，它的高表達刺激了腫瘤細胞的生長。本研究中ERβ在PTC中的表達高于其在NTG中的表達，與Chen等[6]研究結果不同，這可能是因為ERβ亞細胞定位的不同所引起，Chen等[6]對ERβ的結論是基于其在細胞核的表達，而本研究中其主要在細胞核和細胞質同時表達。在浸潤性食管癌中ERβ在細胞質的表達明顯高于在非浸潤性食管癌；在乳腺癌中，ERβ細胞核的高表達時，其內分泌治療有效，預后相對較好[7]。因此推測ERβ在不同部位的表達其作用是不同的。

表2 PTC中ERα、ERβ和MMP-9的表達與臨床病理特征間的關系

注：ERα為雌激素受體α、ERβ為雌激素受體β、MMP-9為基質金屬蛋白酶-9、PTC為人甲狀腺乳頭狀癌

PTC存在明顯性別差異，本研究顯示ERα在女性中的表達明顯高于男性。Zhang等[8]研究發現，雌激素可以促進人甲狀腺癌乳頭狀細胞株(BCPAP)和正常甲狀腺細胞株生長，并且雌激素能夠促進甲狀腺癌細胞的粘連、侵襲和轉移。但是本研究PTC中ERα和ERβ的表達與PTC患者的腫瘤大小、包膜侵犯、淋巴結轉移狀況及TNM分期無關，與Huang 等[9]報道結論相一致，推測ERα和ERβ僅僅參與了雌激素促進PTC發生的過程中，而沒有或很少參與其進展。

腫瘤細胞浸潤轉移的關鍵步驟之一是細胞外基質的降解，MMP-9是重要的細胞外基質降解酶，能通過促進血管生成和降解細胞外基質，使腫瘤發生浸潤、轉移[3]。在本研究中，MMP-9蛋白在PTC中高表達，且在已侵犯腫瘤包膜的腫瘤中的表達高于無包膜侵犯的腫瘤，在無淋巴結轉移組中的表達陽性率高于有淋巴結轉移組，隨著TNM分期的進展呈上升趨勢，在Ⅰ和Ⅱ期中的表達陽性率低于Ⅲ和Ⅳ期。有研究證實，在雌激素受體陽性的乳腺癌細胞中，ERα表達水平與MMP-9呈正相關[10]； 有學者發現ER激動劑能夠通過ERα依賴通路促進卵巢癌細胞轉移，通過ERβ抑制其轉移[11]。本研究結果中MMP-9與ERα蛋白的陽性表達呈顯著正相關，與ERβ蛋白的陽性表達呈顯著負相關。盡管本研究與已有的文獻報道的發生部位不同，但相應地可以因此推測，ERα和ERβ在PTC腫瘤細胞的浸潤轉移機制類似于卵巢癌。當然具體的通路還需要進一步研究。

本研究結果證實，在PTC中，ERα對PTC的發生發展有重要的促進作用，ERβ的亞細胞定位對其在PTC中所起的作用非常重要，而這兩者與MMP-9之間存在著緊密的聯系，或許可以為PTC的個體化治療提供新的線索。

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