地衣芽孢桿菌抗菌肽萃取條件的研究

胡 俊,湯 斌，李 松

(安徽工程大學 微生物發酵安徽省工程研究中心，安徽 蕪湖 241000)

抗菌肽是一種常見的生物拮抗劑，主要表現為對一些G+細菌(特別是一些致病菌，如金黃色葡萄球菌、肺炎雙球菌等)具有一定的拮抗作用[1]，因而在環境保護、醫療衛生和食品加工等眾多領域都有著較為重要的應用．利用微生物生產抗菌肽具有生產周期短，產物易分離純化等優點[2]，是工業上抗菌肽的主要獲得途徑．

抗菌肽純化方法主要包括膜分離、電泳分離、層析技術以及高效液相色譜分離等[3]．在利用高效液相色譜(HPLC)對發酵液中的抗菌肽組分進行分離時，需要先對發酵液進行預處理，以降低分離體系中的蛋白豐度、分離難度以及避免造成儀器損壞．從目前的研究現狀來看，預處理方式主要包括鹽析、色譜柱粗分離、分級沉淀和有機萃取等[4]．胡瑞萍[5]等采用鹽酸沉淀和Sephadex G-50 凝膠柱分離對枯草芽孢桿菌BSD-2抗菌肽進行了粗提??；劉靜[6]等在枯草芽孢桿菌抗菌肽分離純化過程中，采用陰離子交換柱DEAE-Sepharose FF等方式對發酵粗提液進行預處理；劉穎[7]等在分離抗真菌肽的過程中，通過調節發酵液酸堿度以及利用丙酮分級沉淀等方法對目的蛋白進行了粗提．由于抗菌肽具有分子量小、結構簡單、穩定性較高且在有機溶劑和水中都具有一定的溶解性等特點[8]，所以，利用合適的有機溶劑對發酵液中的抗菌肽進行萃取可使其中大多數雜蛋白變性沉淀，而分子量較小的多肽類物質可部分轉移至有機相中．相比其他的預處理方式，此方法操作簡單且能取得較好的預處理效果，使后續HPLC分離過程簡化，因而以此作為發酵液的預處理方法．

研究以地衣芽孢桿菌為生產菌株時，發酵液預處理操作過程中的各實驗因素對抗菌肽的萃取效果和相對應的反萃取效果的影響，以及最佳萃取試劑、萃取和反萃取條件的確定，最終通過蛋白豐度檢測對預處理效果進行了評估．相比其他預處理方式，此方法操作簡單且能較好地達到預處理效果，使后續HPLC分離過程簡化，因而選擇此方法作為發酵液的預處理方法．

1 實驗材料

(1)菌種.地衣芽孢桿菌BL32、金黃色葡萄球菌AS1.2465(以上菌株均為安徽工程大學微生物發酵工程研究中心實驗室篩選保藏)．

(2)試劑與儀器.試劑:氨芐青霉素鈉標準品(160 萬U/g，純度≥99.9%)、乙腈(色譜純)、甲醇(色譜純)、95%乙醇、氯仿(AR)、正丁醇(AR)、異戊醇(AR)、硫酸鎂(AR)、碳酸鈣(AR)、可溶性淀粉、胰蛋白胨、酵母粉(以上藥品均購自國藥集團公司)以及市售豆粕．

儀器：NS4201二元分析液相色譜系統、RE52AA旋轉蒸發儀、FD8-3冷凍干燥機、電熱鼓風式干燥箱．

(3)培養基.LB固體培養基：蛋白胨1%，酵母粉0.5%，NaCl 1%，瓊脂粉1.5%；種子培養基：蛋白胨1%，酵母粉0.5%，NaCl 1%；發酵培養基：可溶性淀粉1%，豆粕2%，硫酸鎂0.02%，碳酸鈣0.05%．

2 實驗方法

2.1 發酵液的獲得

(1)種子液制備.用接種環從斜面菌種保藏管中挑取菌體接種于20 mL種子培養基中，于37 ℃環境中200 r/min震蕩培養18 h備用．

(2)發酵液的獲取.配制上述發酵培養基并加入10 L發酵罐(BIOTECH-10JS-9000C，上海保興生物設備工程有限公司)中進行實罐滅菌，待培養基冷卻至室溫時接入2%的地衣芽孢桿菌種子液．控制發酵條件為37 ℃、溶氧30%(串聯轉速)，發酵過程中恒定pH 6.5(10% 氨水調節)，發酵時間為30 h．發酵結束后[9]，將發酵液進行8 000 r/min離心10 min，取上清液備用．

2.2 抗菌效價與抗菌肽相對含量計算方法

(1)抗菌實驗方法.抗菌實驗方法采取瓊脂表面擴散法[10]．在LB平板表面涂布指示菌，同時在培養基表面放置牛津杯(規格：內徑φ=8 mm)．向牛津杯中加入100 μL待測液，平板置于一定的條件下培養，后測定牛津杯周圍的抑菌圈直徑大?。?/p>

(2)抗菌效價計算方法.準確稱取氨芐青霉素鈉1.000 g，利用超純水配制濃度為1.000 g/mL(160 萬抗菌單位)的氨芐青霉素鈉標準溶液[11]，對此標準溶液進行梯度稀釋分別配制2～20 U/mL的標準溶液備用．取一定量的樣液置入無菌EP管中用無菌水梯度稀釋5～15倍，經0.22 μm的無菌過濾器過濾后按2.2(1)的方法進行抗菌實驗．樣液抑菌效價的測定采用國際上通用的抗生素效價測定方法“杯碟法”中的二計量法[12]．即根據下列公式和抑菌圈的大小得出相應的抗菌效價．

(3)抗菌肽相對含量的測定方法.根據樣液中抗菌物質的含量與其抗菌效價成正比的關系，樣液中抗菌肽的相對含量主要是通過測定抑菌效價的方式體現的．發酵液中抗菌肽相對含量直接通過原發酵液的抗菌效價判斷，萃取操作后溶于有機溶劑和超純水中的抗菌肽相對含量測定方法如下：10 000 r/min離心5 min，收集有機相或水相，利用旋轉蒸發儀濃縮后60 ℃烘干，溶質利用5 mL超純水重新溶解后經0.22 μm水膜過濾．按2.2(2)所述方法測定溶解液抗菌效價．

2.3 發酵液中抗菌肽萃取條件的研究

(1)不同有機溶劑對萃取效率的影響.分別以氯仿、四氯化碳、正丁醇、異戊醇和混合醇(正丁醇∶異戊醇=1∶1)為萃取用的有機萃取劑．將有機溶劑與原發酵液上清液按體積比1∶1混合進行萃取操作．分別收集有機相和發酵液并對其中抗菌肽的相對含量進行測定．每種有機溶劑設3個平行組，抑菌性效價取相對應的平均值．

(2)萃取機溶劑/發酵清液的體積比對萃取效率的影響.控制有機溶劑與發酵清液的體積比分別為1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1進行萃取，測定有機相和水相中的抗菌肽相對含量．各體積比設3個平行組，抑菌性效價取相對應的平均值．

(3)萃取溫度對萃取效率的影響.取適量的有機溶劑和發酵上清液分別置入水浴鍋中保溫30 min，水浴鍋的溫度分別設置為25 ℃、35 ℃、45 ℃、55 ℃和65 ℃．后迅速將有機溶劑與培養液清液按合適的體積比混合，分別收集有機相和發酵液，對兩者溶解的抗菌肽相對含量進行測定．各溫度條件下設3個平行組，抑菌性效價取相對應的平均值．

2.4 反萃取條件的研究

反萃取是指在萃取操作以后，將溶解有抗菌肽的有機溶劑與超純水混合，使得有機溶劑中部分抗菌肽轉移至水相的實驗過程，目的是為了進一步降低待分離體系中的蛋白豐度．

(1)有機相/超純水體積比對反萃取效果的影響.分別設置反萃取過程中 V有機相/V超純水比為1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5，在常溫下充分震蕩混合均勻，按2.2(2)方法對各組有機相以及水相中的抗菌肽相對含量進行測定．各體積比設3個平行組，抑菌性效價取相對應的平均值．

(2)溫度對反萃取效果的影響.取適量的有機溶劑和超純水分別置于溫度設置為25 ℃、35 ℃、45 ℃、55 ℃、65 ℃水浴鍋中保溫30 min后迅速將有機溶劑與超純水按合適的體積比混合，測定各組有機溶劑和水相中抗菌肽的相對含量．各溫度條件下設3個平行組，抑菌性效價取相對應的平均值．

(3)反萃取操作次數對實驗效果的影響.在最適操作溫度條件下，按最適體積比將含有抗菌肽的有機溶劑與超純水進行混合，充分震蕩后離心．收集上層有機相再一次按體積比加入超純水重復上述操作2至5次，分別對每次有機相中剩余的抗菌肽相對含量進行測定．各操作次數設3個平行組，抑菌性效價取相對應的平均值．

2.5 蛋白豐度的檢測

分別取發酵濃縮液、萃取操作后溶有抗菌肽的有機溶劑以及反萃取后溶有抗菌肽的水溶液經0.45 μm膜過濾后進行高效液相色譜分析．色譜檢測條件分別為柱型C18柱(規格：250×8 mm)，操作溫度25 ℃；有機相(A相)為乙腈(色譜純)；非有機相(B相)為超純水；A相由起始濃度30%上升至結束濃度60%;檢測光波長254 nm;分離時間30 min;進液量20 μL．

3 結果與分析

3.1 萃取實驗條件優化

不同有機溶劑萃取液的萃取效率和抑菌效果如圖1、圖2所示.由圖2可知，以正丁醇為萃取溶劑時形成的抑菌圈的直徑較大即以正丁醇為有機溶劑時,發酵液中的抗菌肽可較多的轉移至有機相中，其萃取率為33.14%.其次為混合醇，萃取效果最差的為四氯化碳，其對抗菌肽的萃取率僅有8.28%.

V有機溶劑/V發酵液對萃取效果的影響如圖3所示.溫度對萃取效果的影響如圖4所示.由圖3可知，萃取過程中，不同的有機相與發酵液的體積比對萃取效果有一定的影響，其中設定V有機相/V發酵液為2∶1時，抗菌肽的萃取相比于V有機相/V發酵液為1∶1提高了8.53%．但之后有機溶劑量繼續增加時，萃取率上升并不明顯．同時由圖4可得操作溫度大于45 ℃時，萃取率趨于穩定，但相對于室溫條件下提高了4.5%左右．

由以上優化的數據分析可得出，在發酵液的萃取預處理的過程中，以正丁醇為萃取試劑，最佳效益的萃取條件V有機相/V發酵液為2∶1，萃取溫度為45 ℃．

圖1 有機溶劑對抗菌肽的萃取效率圖2 不同有機溶劑萃取液的抑菌效果

圖3 V有機溶劑/V發酵液對萃取效果的影響圖4 溫度對萃取效果的影響

3.2 反萃取條件優化

不同的V有機相/V超純水對反萃取效果的影響如圖5所示.不同溫度對反萃取效果的影響如圖6所示.有機相中殘留抗菌效價與反萃取次數的關系如圖7所示.由圖5、圖6、圖7可知，在實驗操作中不同的V有機相/V超純水對反萃取的效果沒有較為顯著影響；相對于室溫環境，設定反萃取操作溫度為45 ℃時，單次反萃取率有所提高．而在最適反萃取條件下進行重復操作，進行2次反萃取時，反萃取率相對于單次操作提高了7.84%．因此，在反萃取操作中，設定V有機相/V超純水為1∶1、操作溫度為45 ℃、操作次數為2次時可獲得較好的反萃取效益，反萃取率接近61.28%．

圖5 不同的V有機相/V超純水對反萃取效果的影響圖6 不同溫度對反萃取效果的影響

圖7 有機相中殘留抗菌效價與反萃取次數的關系

圖8 原發酵液蛋白豐度檢測結果

3.3 蛋白豐度的檢測結果分析

原發酵液樣品色譜檢測結果如圖8所示.由高效液相色譜檢測數據可以看出，在原發酵液樣品圖譜中出現峰數目較多，可見原發酵液中蛋白豐度較大，在此基礎上很難直接對抗菌肽進行分離收集．但經過有機萃取操作后，對比原發酵液的檢測結果后發現，圖譜中峰數目明顯下降及大部分的雜蛋白組分可在正丁醇的作用下變性沉淀，繼而被除去(見圖9)．進一步經過反萃取操作，對比圖9可知，分離時間大于6.5 min出現的蛋白組分在水相中溶解度較小并被截留在有機相中，水相的蛋白組分明顯下降(見圖10)．因此通過以上兩步的操作，使得最終待分離體系中的蛋白組成相對簡單，從而達到了較為理想的處理效果．

圖9 萃取操作后溶于有機相蛋白豐度檢測結果

圖10 反萃取操作后溶于水相蛋白豐度檢測結果

4 結論

有機萃取是抗菌肽純化工藝中發酵液的預處理方法，相比與其他方法具有高效簡便的優點．以正丁醇為有機萃取劑，在合適的V有機相/V發酵液和操作溫度條件下，可使地衣芽孢桿菌發酵液中抗菌肽最大限度地轉移至有機相中，然后進一步進行反萃取操作，對影響其效果的操作溫度和反萃取操作次數進行優化．在45 ℃條件下，二次反萃取率接近61.28%，萃取操作可使發酵液中大多數雜蛋白組分被除去，使得后期高效液相色譜的分離工作難度大大降低，從而起到了相應的預處理效果．

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