青島市售酸奶中乳酸菌的分離鑒定及耐藥性研究

◎ 馮金曉，李明珠，馮 倩

（青島工學院食品工程學院，山東 青島 266300）

乳酸菌是一類革蘭氏陽性菌，現已作為益生菌廣泛應用于食品以及藥品領域中[1-3]。但乳酸菌應用所帶來的安全性問題已經引起人們的注意，尤其是某些菌對抗生素的耐藥現象更具有潛在的危險性[4]。一般情況下，耐藥性的傳播主要發生在臨床相關的菌株中，但已有體內實驗證明，在腸道正常菌之間、腸道正常菌與致病菌之間也存在耐藥基因轉移現象[5-6]。因此研究不同發酵食品來源的乳酸菌耐藥性問題，對于乳酸菌在食品中的安全使用具有重要意義。本研究對青島市售酸奶中的乳酸菌進行分離與初步鑒定，并對其進行抗生素耐藥性研究，以期為市售酸奶中發酵乳酸菌的安全性使用提供試驗數據與參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

青島市售酸奶：均購于青島膠州市寶龍大潤發超市，于4 ℃冷藏保存。

1.2 試驗設備

立式壓力蒸汽滅菌器，Thermo Finnpipette移液槍，SW-CJ-1D型單人凈化工作臺，DH4000BII電熱恒溫培養箱，PHS-25型實驗室pH計，722N型分光光度計，LW100B光學顯微鏡。

1.3 試驗方法

1.3.1 培養基配制

MRS培養基、淀粉培養基、明膠液化培養基、葡萄糖蛋白胨水培養基、乳糖發酵培養基、葡萄糖發酵培養基，具體配方及配制方法參見文獻[7]。

1.3.2 樣品的稀釋

于超凈工作臺內，用移液槍從酸奶樣品中吸取1 mL加入到含9 mL無菌生理鹽水的試管中，快速震蕩試管，使其呈1∶10的均勻稀釋液，同法繼續稀釋成10-2、10-3稀釋度稀釋液，按此操作依次制備成A1-A2-A3、B1-B2-B3、C1-C2-C3、D1-D2-D3、E1-E2-E3的樣品稀釋液，其中A～E為樣品編號。

1.3.3 乳酸菌分離純化與形態觀察

（1）初次分離。于超凈工作臺內，將MRS培養基冷卻至50 ℃左右，倒入標有A1-A2-A3、B1-B2-B3、C1-C2-C3、D1-D2-D3、E1-E2-E3的無菌平板中，待完全凝固后，分別用移液槍吸取A～E的樣品稀釋液100 μL置于MRS固體培養基平板上，并用涂布棒涂布均勻后置于37 ℃的恒溫培養箱中倒置培養24、48、72 h，根據菌落的大小、顏色、光澤和透明程度等，對平板中生長的菌落進行形態觀察。

（2）多次分離純化。對以上觀察到的A、B、C、D、E 5種平板中的相同形態菌落和單一平板中不同形態的菌落在無菌條件下進行平板劃線分離。將劃線平板倒置于37 ℃恒溫培養箱中培養24、48、72 h。重復上述操作直至每個平板上只有一種微生物。

（3）形態觀察。菌株染色采用革蘭氏染色法[7]，顯微鏡油鏡鏡檢，記錄觀察結果。

1.3.4 生理生化試驗

根據菌落形態及革蘭氏染色結果，參照《伯杰細菌鑒定手冊》對菌株進行生理生化試驗，包括過氧化氫酶測定試驗、淀粉水解試驗、明膠水解試驗、乙酰甲基甲醇試驗、產氣試驗、葡萄糖發酵試驗、乳酸定性檢測試驗[7-8]。

1.3.5 耐藥性試驗

利用紙片擴散法[9]對分離自A、B、C、D、E 5種酸奶中的乳酸菌進行卡那霉素、鏈霉素、慶大霉素、萬古霉素、環丙沙星、氨芐西林、青霉素、四環素、氯霉素、頭孢唑林10種抗生素的耐藥性試驗。

2 結果與分析

2.1 乳酸菌的分離純化

2.1.1 初次分離

樣品經梯度稀釋后，根據稀釋液濃度不同采用平板涂布法進行分離，37 ℃培養24 h后，在5種稀釋液平板中均生長出一種菌落形態相似的微生物，鑒于菌落形態相似的微生物可能也存在不同的生理生化性質，所以將其分別編號1～5號；37 ℃培養48 h后，平板C中長有另外兩種菌落形態不同的微生物，編號為6號、7號；同樣條件下培養72 h后，在E稀釋液平板中又發現一種與前三種菌落形態不一致的微生物，編號為8號。觀察得到的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ 4種菌落形態不同的微生物，結果如圖1所示。

圖1 菌落形態圖

2.1.2 多次分離純化

在無菌條件下，將上述疑似8種不同的微生物分別挑取后劃線接種到MRS培養基上，37 ℃倒置培養24 h后觀察到1～5號菌的菌落形態一致；培養48 h后，觀察到6號、7號分離純化平板中生長出另外兩種不同形態的菌落；培養72 h后，8號分離純化平板中也長出不同菌落形態的微生物。將這四種菌落形態不同的微生物經三次分離純化后，得到Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ 4種不同的微生物分離純化產物。結果如圖2所示。

圖2 多次分離純化后的菌落形態圖

2.2 形態學觀察

2.2.1 菌落形態

對4種菌落從其顏色、透明度、濕潤度、光滑程度、邊緣整齊度以及培養基變化6個方面進行觀察，結果記錄如表1。

表1 四種菌的菌落形態表

2.2.2 菌種形態

4種菌革蘭氏染色后鏡檢結果如圖3所示。

圖3 革蘭氏染色鏡檢圖

由圖3可知，Ⅰ號菌為短桿狀，Ⅱ號菌為長桿狀，Ⅲ號菌為成鏈的球狀菌，Ⅳ號菌為分散的球狀菌，革蘭氏染色后均呈紫色，故4種菌均為革蘭氏陽性菌[7]；I、Ⅱ號菌為桿菌，Ⅲ號菌為鏈球菌屬，Ⅳ號菌為單球菌屬。

2.3 生理生化試驗

對分離純化后的1～8號菌進行生理生化特征鑒定，結果如表2所示。

表2 八種菌的生理生化試驗結果表

由表2可知，8種菌均能利用葡萄糖及乳糖產酸不產氣，過氧化氫酶試驗陰性，不液化明膠，不水解淀粉，且1～5號菌的生理生化特性相同。結合上述試驗結果并對比查詢《伯杰細菌鑒定手冊》，得出4種形態不同的微生物的初步鑒定結果為：Ⅰ號菌為保加利亞乳桿菌；Ⅱ號菌為雙歧桿菌；Ⅲ號菌為嗜熱鏈球菌，Ⅳ號為乳酸乳球菌。

2.4 耐藥性試驗

對Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ 4種乳酸菌進行了耐藥性試驗，10種抗生素藥敏紙片分別編號1～10，試驗現象以保加利亞乳桿菌為例，如圖4所示。

圖4 藥敏性試驗現象圖

耐藥性試驗的結果見表3。

表3 不同乳酸菌的耐藥性試驗結果表

參照藥物敏感性標準中抑菌圈直徑的判定標準[10]，可得出Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ 4種乳酸菌對10種抗生素的耐藥性結果，如表4所示。

表4 四種乳酸菌對十種抗生素的耐藥性結果表

由表4可知，相對于乳酸球菌屬而言，乳酸桿菌屬總體上對10種抗生素的耐藥性要強，乳酸乳球菌的耐藥性最弱，包括卡那霉素在內的所有抗生素都能抑制它的生長。氨芐西林、四環素、氯霉素、頭孢唑啉對這4種乳酸菌有很強的抑制性；青霉素、慶大霉素、鏈霉素對這4種乳酸菌有較強的抑制性；環丙沙星、萬古霉素、卡那霉素對這4種乳酸菌的抑制性相對較弱。

3 結語

對青島市售酸奶中的菌種進行增殖培養，用平板劃線分離法分離純化出4種菌，根據其菌落特征觀察結果、革蘭氏染色鏡檢結果及生理生化試驗結果，結合《伯杰細菌鑒定手冊》確定了這4種菌分別是保加利亞乳桿菌、雙歧桿菌、乳酸鏈球菌、乳酸乳球菌。對4種菌進行卡那霉素、鏈霉素、慶大霉素等10種抗生素的耐藥性試驗，結果表明：4種菌對氨芐西林、四環素、氯霉素、頭孢唑啉普遍敏感，對青霉素、慶大霉素、鏈霉素部分敏感，對環丙沙星、萬古霉素、卡那霉素存在普遍耐藥性。

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