乳癖消顆粒對乳腺增生大鼠抗氧化能力及雌孕激素比值的影響*

河北中醫學院

李杰茹 韓聚強 傅 天 李志麗 康立英 馬志紅 石 紅△(石家莊 050200)

方 藥 研 究

乳癖消顆粒對乳腺增生
大鼠抗氧化能力及雌孕激素比值的影響*

河北中醫學院

李杰茹 韓聚強 傅 天 李志麗 康立英 馬志紅 石 紅△(石家莊 050200)

目的：研究乳癖消顆粒對乳腺增生大鼠體內抗氧化能力和雌孕激素的影響，為藥物的臨床應用提供實驗依據。方法：采用雌、孕激素聯合造模制成大鼠乳腺增生模型，用藥后觀察各組大鼠乳頭外觀，檢測各組大鼠血清中超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)的活性及各組大鼠血清中丙二醛(MDA)和8-羥基脫氧鳥苷(8-OhdG)的含量，應用放免法檢測血清中雌二醇(E2)和孕酮(P)的濃度，同時計算二者比值。結果：乳癖消3個劑量組均可明顯降低大鼠乳頭的高度和直徑(P<0.05)；高、中劑量組能顯著降低MDA和8-OhdG的含量，升高SOD和GSH-Px活性(P<0.05或P<0.01)；乳癖消各組均可降低血清中E2，提高P水平，改善二者比值。結論:乳癖消顆粒對乳腺增生大鼠有較好的治療作用，其治療機制可能與增強乳腺增生大鼠體內抗氧化能力及調節雌孕激素，改善E2/P比值有關。

乳癖消；乳腺增生；他莫昔芬; 氧自由基；抗氧化力；E2/P；雌孕激素

乳腺增生是婦科的一種常見病，隨著生活水平的提高，膳食結構的改變，工作壓力的增大，發病率逐年上升且出現年輕化的的趨勢，已經很大程度上影響了女性的生活質量。乳癖消顆粒作為一副中成藥在臨床應用中對乳腺增生癥的治療有良好的效果。[1-3]但確切的作用機制尚未完全清楚，本研究旨在通過復制大鼠乳腺增生模型，利用現代生物化學技術對中成藥乳癖消顆粒作用后大鼠血清中超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、8-羥基脫氧鳥苷(8-OhdG)水平及雌二醇(E2)和孕酮(P)的濃度進行檢測，為進一步研究乳癖消顆粒治療乳腺增生癥的治療機制提供有力的實驗依據。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑 乳癖消顆粒(鹿角、蒲公英、昆布、天花粉、雞血藤、三七、赤芍、海藻、漏蘆、木香、玄參、牡丹皮、夏枯草、連翹、紅花等藥物組成，哈爾濱泰華藥業股份有限公司)含生藥量(6 g生藥/8 g)，苯甲酸雌二醇注射液(上海通用藥業股份有限公司)，黃體酮注射液(浙江仙琚制藥股份有限公司)，枸櫞酸他莫昔芬(蘇州第一制藥有限公司)，SOD測試盒、MDA測試盒和GSH-Px測試盒購自南京建成生物研究所，8-OhdG試劑盒購自上海西唐生物科技有限公司。

1.2 動物 62只雌性未孕 SD大鼠(體質量180～220 g)購自河北醫科大學實驗動物中心，動物合格證編號：1405026，許可證號：SCXK(冀)2013-1-003。

2 實驗方法

2.1 大鼠乳腺增生模型的建立 將62只雌性未孕SD大鼠，隨機選出10只作為正常對照組，肌注生理鹽水30 d；其余大鼠苯甲酸雌二醇注射液 0.5 mg/kg肌肉注射，1次/d，連續25 d，后改用黃體酮注射液 5 mg/kg，肌肉注射，連續5 d，30 d后在模型組隨機取2只大鼠處死，取其乳腺組織作病理切片觀察，確認模型建立成功。模型復制成功后，將模型大鼠隨機分為5組，模型對照組、他莫昔芬組、乳癖消顆粒低劑量組、中劑量組和高劑量組，每組10只。

2.2 給藥方法 臨用前將乳癖消顆粒溶于蒸餾水配制成濃度分別為13 g/100 mL、26 g/100 mL和52 g/100 mL低、中、高劑量3種溶液。乳癖消顆粒各組按低、中、高劑量組分別灌胃1.3、2.6、5.2 g/kg，連續30 d，1次/d；陽性對照組灌胃他莫昔芬，劑量為1.8 mg/kg，正常對照組、模型組灌服生理鹽水10 mL/只；1次/d，連續30 d。每周測量大鼠第2對乳頭高度1次。末次給藥后1 h，25%氨基甲酸乙酯4 mL/kg腹腔注射麻醉，腹主動脈采血，3 000 r/min低溫離心10 min，分離血清,4℃冰箱存放。

2.3 大鼠血清中氧化劑和抗氧化指標的檢測 取血清分別按SOD、GSG-Px和MDA 試劑盒說明書步驟操作，比色法測定吸光度(A)值，按公式計算出血清中各檢測指標含量。血清中8-OhdG的水平采用ELISA法檢測，使用的是抗8-OhdG單克隆抗體。用微孔過濾器預處理血液樣本。每支試管加入 200 μL血清，1 500 r/min離心 30 min，取上清，加入一抗，在另一試管中加入樣本，平板震動，4℃下孵育過夜。每支試管用250 μL 沖洗液沖洗3次，加入二抗，平板振動，在室溫下孵育1 h。然后在每支試管中加入100 μL反應中止液，平板振動，平板顯示器上以450 nm 測量被吸收者。標準曲線用來計算樣本中 8-OhdG的量。

2.4 大鼠血清中雌孕激素的檢測 應用放免法檢測血清中E2和P的濃度，同時計算二者比值。

3 治療結果

3.1 對各組大鼠乳頭高度及直徑的影響 結果顯示：與正常對照組比較，乳腺增生模型組大鼠乳頭高度、乳頭直徑顯著增高(P<0.05 )；與乳腺增生模型組比較，乳癖消顆粒各劑量組大鼠乳頭高度、乳頭直徑均明顯偏小(P<0.05 ) ，詳見表1。提示乳癖消顆粒具有改善大鼠乳腺組織增生的功效。

組別n劑量乳頭高度(mm)乳頭直徑(mm)正常對照組102mL生理鹽水107±016 102±011 模型對照組102mL生理鹽水169±021?166±014?他莫昔芬組1018mg/kg133±020#115±015#乳癖消低劑量組1013g/kg148±034#146±021#乳癖消中劑量組1026g/kg136±029#131±015#乳癖消高劑量組1052g/kg132±020#124±032#

注：與正常對照組比較，*P<0.05；與模型對照組比較，#P<0.05

3.2 乳腺增生大鼠體內氧化及抗氧化指標的變化 結果顯示：與正常對照組比較，乳腺增生模型組大鼠血清中MDA和8-OhdG的含量明顯增高(P<0.01)；而SOD活性及GSH-Px活性則顯著降低(P<0.01)。詳見表2、表3。提示乳腺增生大鼠存在DNA損傷和組織過氧化損傷，且抗氧化能力降低。

3.3 乳癖消顆粒對乳腺增生大鼠血清中SOD 、GSH-Px酶活性及MDA和8-OhdG的含量的影響 與乳腺增生模型組大鼠對比，乳癖消高、中、低劑量組大鼠血清GSH-Px活性明顯增高(P<0.01)，血清MDA含量明顯降低(P<0.01)，乳癖消高、中劑量組大鼠血清SOD活性明顯增高(P<0.05)，血清8-OhdG的含量明顯降低(P<0.05)，低劑量組SOD及8-OhdG無明顯改變(P>0.05)；與他莫昔芬組比較,高劑量組大鼠血清中SOD 、GSH-Px、MDA和8-OhdG無明顯的變化(P>0.05)。詳見表2、表3。結果顯示:乳癖消顆粒具有抑制脂質過氧化、DNA氧化損傷及清除自由基的作用。

組別n劑量SOD(U/mL)GSH-Px(U/mL)正常對照組102mL生理鹽水1721±1262 8729±1365 模型對照組102mL生理鹽水1345±1426??3833±1155??他莫昔芬組1018mg/kg1601±1276## 7903±2084##乳癖消低劑量組1013g/kg1317±1193 4301±1543##乳癖消中劑量組1026g/kg1601±1040## 5517±2048##乳癖消高劑量組1052g/kg1693±1426## 8285±2021##

注：與正常對照組比較，** P<0.01；與模型組對照組比較，## P<0.01

組別n劑量MDA(nmol/mL)8-OhdG(ng/mL)正常對照組102mL生理鹽水441±0546 1189±0383 模型對照組102mL生理鹽水1250±0648??1295±1010??他莫昔芬組1018mg/kg685±0678##1206±0775# 乳癖消低劑量組1013g/kg1118±0769##1273±1193 乳癖消中劑量組1026g/kg861±0561##1211±0673# 乳癖消高劑量組1052g/kg641±0554##1205±0789#

注：與正常對照組比較，** P<0.01；與模型對照組比較，#P<0.05,## P<0.01

3.4 乳腺增生大鼠中E2、P和E2/P的變化 與正常對照組比較，乳腺增生模型組大鼠血清中E2的含量明顯增高(P<0.01)，P的含量顯著降低(P<0.01)，E2/P比值明顯升高。詳見表4。結果顯示：乳腺增生大鼠體內E2和P水平失調。

3.5 乳癖消顆粒對乳腺增生大鼠血清中E2、P和E2/P的影響 與乳腺增生模型組大鼠對比，乳癖消顆粒各劑量組大鼠血清E2含量明顯降低(P<0.01)，P含量明顯增高(P<0.05)，E2/P比值明顯降低；與他莫昔芬組比較, 乳癖消顆粒各劑量組大鼠血清E2、P含量和E2/P比值無明顯的變化(P>0.05)。詳見表4。結果顯示:乳癖消顆粒有調節體內E2、P含量，改善E2/P比值的作用。

組別n劑量E2(pmol/L)P(nmol/L)E2/P正常對照組102mL生理鹽水13884±2074 67148±3028 025±010 模型對照組102mL生理鹽水24240±6043??17194±10073??194±118??他莫昔芬組1018mg/kg17048±3019??41615±10172??042±004??乳癖消低劑量組1013g/kg15707±3022??44727±19169??042±022??乳癖消中劑量組1026g/kg13910±4502??32342±11941??045±010??乳癖消高劑量組1052g/kg13191±1425??32542±12663??046±017??

注：與正常對照組比較，** P<0.01；與模型對照組比較，## P<0.01

4 討論

乳腺增生癥病因并不明確，目前主要認為是激素分泌失調，一是體內雌激素過量不良刺激乳腺組織而使乳腺組織產生增生性變化，二是雌激素與孕激素平衡失調，患者血漿中E2水平明顯增高，黃體酮分泌相對不足，使乳腺導管擴張和囊腫形成，發生周期性增生過度和復原不全，致乳腺導管、小葉及周圍結締組織細胞增生。本實驗采用雌孕激素制備大鼠乳腺增生病模型，制備的模型大鼠均表現為乳頭、乳房增大、血清中E2含量增高和P含量降低，E2/P比值失調。乳癖消能抑制實驗性乳腺增生癥大鼠的乳頭和乳房增大，明顯降低血清E2濃度，升高P濃度，改善 E2/P比值。證實了乳腺增生與體內激素分泌失調有關。

乳腺增生病的發生，除了體內激素分泌改變之外，近年來的研究發現，乳腺增生患者血清內氧自由基增多,[4]應用具有抗氧化能力的維生素治療乳腺囊性增生病臨床效果肯定，[5]與正常對照組比較，乳腺增生模型組大鼠血清中SOD及GSH-Px活性顯著降低，MDA含量明顯增多，[6-9]因此提示乳腺增生與體內及乳腺組織內氧自由基增多有關。

活性氧簇(ROS)是生物體細胞內多種氧化還原反應的正常代謝產物，肌體在正常生理情況下，ROS的產生和清除處于動態平衡，但當肌體在有害因素的作用下，體內氧化與抗氧化作用失衡，導致肌體ROS產生過多，引起蛋白變性，脂質過氧化，DNA氧化損傷，從而誘發和加重疾病的發生發展。

8-OhdG、MDA 、SOD和GSP-Px是反應體內氧化抗氧化能力的重要指標。本研究發現，與正常對照組比較，乳腺增生模型組動物血清中SOD及GSH-Px活性明顯減弱， MDA和8-OhdG含量明顯增多，也證實了乳腺增生的發生與乳腺組織的氧化損傷有關，表明除內分泌失調外，氧自由基增多致使脂質過氧化損傷及DNA損傷也可能是引起乳腺增生的原因之一，可見抗氧自由基損傷可能是治療乳腺增生的機理之一。本研究發現，乳癖消顆粒降低血清MDA、8-OhdG含量、提高SOD及GSH-Px活性，提示乳癖消顆粒具有明顯的抗氧自由基損傷作用，從而達到治療乳腺增生的目的，為臨床上乳癖消治療乳腺增生病提供了一定的實驗理論依據。

[1]張軍麗.乳腺增生的常用藥物分析[J].中外醫療，2009,27(4):95

[2]高飛鈺，張玉蓮.乳癖消配合他莫昔芬治療乳腺囊性增生癥96例[J].陜西中醫，2009，30(4):444

[3]周阿高，李琰．中醫藥對乳腺癌患者生存質量影響的Meta分析[J].中國實驗方劑學雜志，2012，18(5):220

[4]高立新，沙文，李小燕，等.維生素E治療乳腺增生的機制探討[J].河南診斷與治療雜志，2001，15(2)：124-125

[5]才忠啟，楊賀慶. Β-胡蘿卜素、維生素E和維生素B2聯合治療乳腺囊性增生病的臨床觀察[J].河北醫科大學學報，2010,31(1)：33-35

[6]梁文波，陳杰，邢福有.西黃丸治療大鼠乳腺增生病作用機制的研究[J].遼寧中醫雜志，2007, 34(2)：232-233

[7]王忠超，李敏，張彬.蒙藥乳腺-Ⅰ號對乳腺增生大鼠抗氧化能力、乳腺組織雌激素受體和孕激素受體表達的影響[J].吉林大學學報(醫學版)，2012,38(6)：1 052-1 057

[8]陳莎莎，郭巧生，金融，等. 乳塊消方對實驗性乳腺增生大鼠的影響[J].中國中藥雜志，2007,32(12)：1 198-1 202

[9]劉聰，岳永花，郝旭亮. 柴青消癖膠囊對乳腺增生模型大鼠的治療作用研究[J].藥物評價研究，2013,36(1)：13-17

(2016-10-21 收稿)

*河北省科技廳計劃項目：No.152777131；河北省人口計生委科研計劃項目：No.2010-C12；河北中醫學院青年自然基金項目：No.QNZ2015012

韓聚強，副教授，從事老年疾病研究。

R285.5

A

1007-5615(2016)04-0032-03

△石家莊市第一醫院(石家莊 050011)