苦參堿抑制膠質瘤U251細胞增殖作用及其凋亡機制研究*

江蘇省徐州市中心醫院腫瘤內科

王水英 卞 方 于 洋 王 群 王永林 劉 勇(徐州 221009)

苦參堿抑制膠質瘤U251細胞增殖作用
及其凋亡機制研究*

江蘇省徐州市中心醫院腫瘤內科

王水英 卞 方 于 洋 王 群 王永林 劉 勇(徐州 221009)

目的：研究苦參堿對膠質瘤U251細胞增殖影響，并進一步探討其作用潛在的分子機制。方法：MTT法檢測苦參堿對U251細胞增殖抑制作用；TUNEL方法及流式細胞術檢測苦參堿誘導U251細胞凋亡情況；采用Western blot方法檢測U251細胞上凋亡相關蛋白Bcl-2、Bax蛋白表達變化。結果：苦參堿可以抑制U251細胞增殖，差異有顯著性(P<0.05)，呈時間和濃度依賴性；而在同條件下對人正常視網膜色素上皮RPE細胞無抑制作用，差異無顯著性(P>0.05)；其次苦參堿能誘導U251細胞凋亡，進一步研究發現苦參堿可以影響蛋白Bcl-2、Bax表達。結論：苦參堿能抑制U251細胞增殖、誘導其凋亡，其機制可能與下調U251細胞上抑制細胞凋亡蛋白Bcl-2表達，同時上調促細胞凋亡Bax 蛋白表達有關。

苦參堿；膠質瘤；U251細胞；Bcl-2；Bax；細胞增殖；細胞凋亡

腦膠質瘤是神經系統常見的惡性腫瘤，其惡性程度高，其致殘率及致死率高，預后極差，[1]盡管手術、化療、放療等綜合治療水平在不斷提高，但是腦膠質瘤患者生存期近年來并無多大改善，目前已成為神經系統惡性腫瘤治療的一大難題，[2-3]尋求有效治療手段迫在眉睫。近年來中草藥在治療惡性腫瘤的研究方面取得可喜進展，苦參堿是一種廣譜的抗腫瘤中藥提取物，研究顯示其可以通過多種途徑起到抗腫瘤作用，[4-6]目前已廣泛應用于臨床，但是其對腦膠質瘤作用如何，研究的相關文獻很少，筆者體外研究觀察到苦參堿能顯著抑制人腦膠質瘤U251細胞增殖，并進一步深入研究其作用機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 MTT、DMSO(Sigma公司)；胎牛血清、胰蛋白酶、DMEM及F12培養液(HyClone公司)；Human Bcl-2 mAb、Human Bax mAb(R&D公司)。

1.2 細胞及細胞培養 U251、RPE細胞購自中國科學院上海細胞庫；細胞培養于含10%胎牛血清、1%雙抗的DMEM或F12培養液中，培養37℃、5% CO2及飽和濕度培養箱中培養。

1.3 藥物配制 苦參堿用生理鹽水配制，采用0.22 μm濾器過濾除菌，4℃保存，實驗時用對應的培養基稀釋。

1.4 MTT法檢測細胞增殖 收集對數生長期的細胞，接種于96孔培養板，接種數1×105個/mL，然后培養于培養箱中，實驗組用不同濃度的苦參堿處理細胞24、48、72 h，對照組加等劑量培養基，處理相同時間，在培養結束前4 h，每孔加入濃度為5 mg/mL的MTT 20 μL，繼續培養4 h后，每孔加入100 μL的DMSO，酶標儀檢測490 nm處的光密度；細胞增殖抑制率=[(1-實驗組OD值)]/對照組OD值×100%。

1.5 TUNEL一步法及流式細胞術檢測苦參堿對U251細胞凋亡的影響 取對數生長期的膠質瘤細胞U251，胰酶/EDTA消化，細胞計數。按 4×105/孔將膠質瘤細胞U251接種于6孔板,培養至24 h至細胞貼壁，加入苦參堿各濃度，對照組加入等劑量培養基，培養作用48 h后，按照TUNEL一步法，經固定、封閉等步驟，最后熒光顯微鏡檢測，激發波長450～500 nm。同樣方法得到苦參堿干預后U251細胞，經胰酶消化、收集細胞，按照說明經Annexin V/FITC 和碘化丙錠溶液處理后，流式細胞儀檢測分析。

1.6 Western blot檢測蛋白表達 收集苦參堿干預48 h后U251細胞(方法同前1.4)，提取總蛋白，進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉膜，脫脂奶粉封閉過夜后，加入一抗Bcl-2、Bax，室溫作用1 h；加二抗后室溫1 h，DAB方法顯色，在成像系統中掃描分析結果。

2 結果

2.1 苦參堿可以抑制腫瘤細胞U251增殖 圖1A顯示苦參堿不同濃度(0.2、0.4、0.6、0.8 mg/mL)作用RPE細胞48 h后，對RPE細胞抑制作用，與對照組相比，差異無顯著性(P>0.05)，結果表明：苦參堿(0.2、0.4、0.6、0.8 mg/mL)對RPE細胞無增殖抑制作用，可以排除苦參堿在上述設置濃度范圍內對正常RPE細胞無毒副作用。[7]圖1B顯示苦參堿不同濃度(0.2、0.4、0.6、0.8 mg/mL)及不同時間(24、48、72 h)對U251細胞增殖抑制作用，由圖1B可以得出結論：苦參堿對U251細胞有增殖抑制作用，且呈時間和濃度依賴性，其半數抑制率(IC50)在不同時間(24、48、72 h)分別約為1.2、0.8、0.6 mg/mL。

圖1A 苦參堿不同濃度48 h后對RPE細胞無增殖影響

圖1B 苦參堿不同濃度及不同時間對U251細胞增殖抑制作用(與對照組相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001)

2.2 苦參堿誘導U251細胞凋亡情況

2.2.1 苦參堿干預U251細胞 苦參堿0.6 mg/mL干預U251細胞48 h后，洗滌后經固定、封閉等步驟，最后熒光顯微鏡檢測(圖2A-B)。

A 對照組 B 藥物組

2.2.2 流式細胞術檢測苦參堿誘導U251細胞凋亡:圖3A-B顯示苦參堿不同濃度干預U251細胞48 h后，隨著苦參堿濃度增大，苦參堿誘導U251細胞凋亡百分比呈明顯增多趨勢，與對照組相比，差異有顯著性(P<0.05)。

A

B

圖3A-B 苦參堿可以誘導U251細胞凋亡(與對照組相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001)

2.3 Western blotting檢測bcl-2、bax蛋白表達 不同濃度的苦參堿(0.4、0.6、0.8 mg/mL)干預U251胞48 h后，檢測U251細胞上bcl-2、bax蛋白表達，由圖4A-B可以得出結論：隨著藥物濃度的增加，U251細胞上抑制細胞凋亡蛋白Bcl-2表達呈下降趨勢，而促細胞凋亡蛋白Bax表達呈上升趨勢，與對照組相比，差異有顯著性(P<0.05)。

3 討論

腦膠質瘤是顱內常見惡性腫瘤，其惡性程度高，預后差，5年生存率低于10%,[8-9]盡管國內外眾多專家學者對腦膠質瘤進行了不懈的研究探索，[10]近年來治療手段均有不斷新的研究報道，但是其生存期未見顯著提高，嚴重危害了人們身體健康。

中藥苦參堿是目前臨床應用及研究較多的中藥提取物，它廣泛存在于豆科植物苦參、苦豆子中，《本草綱目》記載：苦參，苦寒，無毒，主治心、腹結氣、癥瘕積聚、黃疸、溺有余瀝，逐水、補中明目、養肝膽氣、并具有清熱解毒、祛風燥濕、殺蟲、治蟲、治皮肌煩躁生瘡，治腸風、瀉血并熱痢之功效。在目前眾多研究及使用過程中已發現苦參堿在抗腫瘤方面作用顯著，對腫瘤細胞有直接殺傷作用，或直接毒性作用，且本身具有毒性低、不抑制骨髓和提高肌體免疫功能等優點，但是其對腦膠質瘤作用如何，目前研究的不多，筆者體外觀察到苦參堿對人腦膠質瘤U251細胞有增殖抑制作用，進一步研究發現其可以誘導U251細胞凋亡，可以影響凋亡相關蛋白Bcl-2、Bax的表達。

A

B

圖4 A-B 苦參堿可以下調U251細胞上Bcl-2的表達，而同時上調Bax蛋白的表達(與對照組相比，*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001)

Tsujimoto等1984年首次從濾泡性淋巴瘤中分離一種癌基因Bcl-2。緊接著Bcl-2被報道能抑制細胞凋亡，延長細胞壽命。[11-12]Oltvai等發現了Bcl-2相關蛋白Bax，它能促進細胞凋亡。[13]隨診研究的深入，在Bcl-2家族已發現抑制細胞凋亡的還有BCL-XL、Mcl-1等，促進細胞凋亡還有Bax、bcl-xs等，但目前Bcl-2和Bax是一對研究最多的細胞凋亡調控基因，細胞中Bcl-2/Bax比值決定細胞接受致病信號刺激后存活與否的關鍵。[14]本實驗體外觀察到苦參堿可以抑制腦膠質瘤細胞增殖，且呈時間濃度依賴性，差異有顯著性。而在相同濃度條件下對人正常RPE細胞無增殖抑制，由此可以排除苦參堿在有效濃度下毒性問題。緊接著本研究運用了TUNEL和流式細胞術分別觀察到苦參堿可以誘導U251細胞凋亡，進一步檢測了苦參堿干預U251細胞后，調控細胞凋亡蛋白Bcl-2/Bax表達情況，令人鼓舞的是，抑制細胞凋亡蛋白Bcl-2蛋白被下調，同時促細胞凋亡蛋白Bax被上調，或許是苦參堿誘導U251細胞凋亡的機制之一，根據統計學分析，呈現出濃度依賴性。

綜上所述，可以認為苦參堿可以通過調控細胞凋亡蛋白Bcl-2/Bax比值，誘導U251細胞凋亡，進而抑制細胞增殖。值得思考的是，苦參堿能抑制U251細胞增殖，是否還存在其它抗腫瘤機制，目前還不清楚，臨床上苦參堿能否通過血腦屏障治療腦膠質瘤、療效又如何等諸多問題擺在面前，還需進一步的基礎及臨床實驗研究。

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(2016-10-24 收稿)

*上海人才發展基金資助項目：No.2009-022

劉勇，男，主任醫師，碩士生導師。

R285.5

A

1007-5615(2016)04-0035-04