一株產紅色素真菌的鑒定及其色素性質的研究

付金菊，王強，陳玉龍，楊清香

（河南師范大學生命科學學院，河南新鄉453007）

目前，色素在食品和飼料行業中的應用日益劇增，具有廣闊的市場前景。天然提取色素主要來源于有色植物，受到原料等因素的制約，植物色素含量低、品質差異大，價格昂貴[1]。人工合成色素的安全性向來受到爭議，難以在食品領域得到廣泛的應用。利用微生物生產色素不僅克服了上述困難，而且微生物色素通常比植物或動物源色素具有更高的穩定性和溶解性[2]。因此，利用微生物生產色素受到了越來越多研究者的關注。在產色素的微生物中，絲狀真菌色素含量高，易培養，成為微生物色素的重要來源，已報道的真菌色素近600種，如紅曲紅色素、類胡蘿卜素、蝦青素等[3]。真菌色素不僅在化學結構上表現出多樣性，而且擁有豐富多彩的顏色，是主要的產色素微生物[4]。真菌不僅能在固體培養基中產生色素，在液體培養基中同樣能產生大量色素，適宜于規模化生產[5]。然而，目前具有市場應用價值的微生物源色素依然有限，尋找有價值的色素仍然任重道遠。

本研究從三孢布拉霉培養過程中的污染平板上篩選得到一株產紅色素的絲狀真菌，初步判斷該色素與番茄紅素完全不同。為了進一步挖掘該絲狀真菌產紅色素的潛在價值，我們對該真菌進行了分子生物學鑒定，并對該紅色素進行了提取和初步分離，以及對常見物理化學因素的穩定性。

1 材料與方法

1.1 菌株的培養

培養基：麥芽汁培養基、pH值自然[6]。

平板培養：將保藏于20%甘油里的菌液接種于6°麥芽汁固體培養基上，28℃下培養4 d。

發酵液培養：無菌條件下，用接種環從培養好的平皿中挑取一環接種于6°麥芽汁液體發酵培養基中，28℃，180 r/min培養5 d。

1.2 主要儀器

高速冷凍離心機：德國Sigma公司；LRX系列生化培養箱：上海恒科有限公司；電熱恒溫水浴鍋：上海醫療器械廠；離心機（5415R）：德國EPPENDORF公司；電泳儀：Powerpac USA；超凈工作臺：AIR TECH蘇州凈化設備有限公司；高壓蒸汽滅菌鍋（MLS－3781L－PS）：松下健康醫療器械株式會社；紫外可見分光光度計（UV2600）：島津儀器（蘇州）有限公司。

1.3 菌株的分子生物學鑒定

從培養的單菌落上挑取適量的菌體，用Takara微生物細胞裂解液裂解細胞，以細胞裂解液為模板，進行PCR擴增，以ITS序列通用引物ITS1、ITS4進行PCR 擴增[7]。各引物序列如下：ITS1（5′TCCGTTAGGTGAACCTGCGG3′），ITS4（5′TCCTCCGCTTATTGATATGC3′）所有引物均由上海生工公司合成。PCR擴增的反應體系為：25 μL的總反應體積中包含1 μL DNA模板，每個引物 0.8 μL，12.5 μL Mix，加水至 25 μL。擴增條件：95℃預變性5min，然后進行35個循環的擴增（細菌 94℃ 40 s，55℃ 90 s，72℃ 90 s；真菌 94℃ 30 s，54℃30 s，72℃1min），最后72℃延伸10min，PCR反應結束后，取5 μL反應產物，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測目的條帶。將目的片段的PCR產物送到上海生工公司進行測序，利用BLAST與GenBank數據庫中18S rRNA基因和真菌ITS序列進行比對分析，通過MEGA4.1軟件對同源序列以及相關標準菌株的序列進行多重序列比對，使用Neighbor－Joining構建系統發育樹法，確定菌株的分類水平。

1.4 產色素真菌的發酵曲線的測定

配30瓶發酵液，每瓶接種2 mL濃度為107個/mL的孢子懸液。從發酵開始，每隔12小時取3瓶發酵液，離心，上清液在495 nm波長下測定紅色素的吸光值。菌絲體用洗滌3次，105℃烘干至恒重，即為生物量。

1.5 紅色素的提取

將菌株在發酵培養基中培養5天后，取25 mL發酵液，8 000 r/min 離心 10min，取上清液，使用 0.45 μm膜過濾，留下濾液。將紅色素提取液分別與等體積的乙醇，乙酸乙酯，石油醚混合，充分搖勻后靜置，觀察互溶情況。

1.6 全波長光譜掃描與高效液相色譜分析

將發酵120 h的發酵液過0.45 μm濾膜后，利用紫外可見分光光度計－UV2600對濾液進行全波長掃描，確定最大吸收波長。

色素成分分析采用高效液相色譜法，色譜柱為ZORBAX Eclipse Plus C18 柱（250 mm×4.6 mm）。流動相為乙腈 ∶水=60∶40，流速1 mL/min，檢測波長為495 nm。

1.7 紅色素穩定性檢測

用蒸餾水將紅色素適當稀釋，直到其吸光度范圍在0.3～0.8之間，記下此時的吸光度，稀釋過的色素用于色素的穩定性檢測。

1.7.1 pH 值對色素穩定性的影響

分別取稀釋后的色素樣品5 mL于9支試管中，用氫氧化鈉和鹽酸將色素溶液調成不同的pH值，靜置30min后，在波長為495 nm處測定色素吸光度。

1.7.2 溫度對色素穩定性的影響

分別取稀釋后的色素樣品5 mL于5支試管中，置于 20、40、60、80、100℃下的恒溫水浴鍋中，每個溫度下處理30min后拿出，在波長495 nm下檢測吸光度。

1.7.3 光照時間對色素穩定性的影響

分別取稀釋后的色素樣品5 mL于8支試管中，分別置于自然光和紫外光下，照射 0、2、4、6、8、10 h 后，在波長為495 nm下測定其吸光度。

1.7.4 過氧化氫對色素穩定性的影響

分別取稀釋后的色素樣品5 mL于8支試管中，向試管中各添加 0、1、2、3、4、5 mL 10%的過氧化氫溶液，然后用蒸餾水定容至10 mL，充分震蕩后靜置2 h，在波長為495 nm處檢測吸光度。

1.7.5 亞硫酸鈉對色素穩定性的影響

分別取稀釋后的色素樣品5 mL于8支試管中，向試管中各添加 0、1、2、3、4、5 mL 10%的亞硫酸鈉溶液，然后定容至10 mL，震蕩后靜置2 h，在波長為495 nm處檢測吸光度。

2 結果與分析

2.1 產色素真菌的分離純化及形態特征

在培養產番茄紅素的三孢布拉霉固體平板上污染一株霉菌，其菌落周圍出現紅色，其菌絲特征和產生的紅色素在培養基中的擴散特征均明顯不同于三孢布拉霉菌及其產生的番茄紅素。將該菌株分離純化，菌落形態如圖1所示。

圖1 產紅色素真菌的菌落特征Fig.1 Colony characteristics of red-pigment-producing fungi

從菌落形態上判斷，該霉菌與三孢布拉霉具有很大差異，菌落表面呈深綠色，并且向周圍培養基中滲透大量紅色素。而三孢布拉霉的菌落呈黃色，并且不會向周圍培養基中滲透色素。因此，該霉菌很可能是一株分泌胞外色素的真菌，具有潛在的價值，值得進一步對菌種和所產色素進行鑒定。

2.2 產色素真菌的分子生物學鑒定

為了進一步鑒定該產色素真菌，擴增該真菌核糖體rRNA基因的IT1－IT4序列，并測序，將該序列在NCBI上進行同源性比對，選取同源性較高的序列，并使用Neighbor－Joining構建系統發育樹，結果如圖2所示。

從系統發育樹中可以看出，菌株YW1的IT1－IT4序列與踝節菌屬（Talaromyces）的產紫踝節菌（Talaromyces purpurogenum）在發育樹上聚為一簇，具有99%的相似性。因此，本研究將該產色素真菌命名為T.purpurogenum YW1。

圖2 產色素真菌YW1的Neighbor-joining系統進化樹Fig.2 Phylogenetic tree of T.purpurogenum YW1（Neighbor-joining）

2.3 產色素真菌的發酵曲線

產色素真菌的的生長過程曲線和紅色素的合成過程曲線如圖3所示。

圖3 產色素真菌的發酵曲線Fig.3 Fermentation curve of pigment fungi

從圖3中可以看出，該產色素真菌的生長速度較快，經過短暫的適應期后，在發酵48 h生物量達到最大值[（13.51±1.22）g/L]，隨后進入穩定期，并在96 h后生物量開始緩慢下降。紅色素的合成是在發酵36 h后開始，在48 h～96 h內快速合成，隨后保持穩定。從發酵曲線可以看出，紅色素的合成是在霉菌進入穩定期后開始的，是霉菌的次級代謝產物，這與大多數真菌色素相似。

2.4 紅色素的提取和分離

2.4.1 紅色素在不同溶劑中的溶解性

為了確定合適的提取溶劑，本研究將發酵液與不同極性的有機溶劑混合，靜置分層后，出現了不同的分層情況。在極性較弱的石油醚中，明顯的分為兩層，色素集中在水相，有機相中幾乎沒有顏色。當發酵液與乙酸乙酯互溶后，有機相中呈現黃色，水相為紅色。當發酵液與極性較大的乙醇互溶后，沒有出現分層，色素均勻的分布在溶液中。據此可以推測，該紅色素是具有較強的極性，可能是多種色素混合在一起，且主要為水溶性色素。水作為色素提取溶劑，不僅無毒、價格低廉，而且操作簡單，遠遠優越于三孢布拉霉產生的番茄紅素的提取。通過對發酵液離心，得到的菌絲體用水洗滌5次，菌絲體接近無色，說明色素為胞外產物。與三孢布拉霉產生的番茄紅素相比較，減少了細胞破壁過程，大大節約了時間和色素提取成本。

2.4.2 色素的光譜吸收特征和組分分析

將發酵液過0.45 μm濾膜后，利用紫外可見分光光度計－UV2600對濾液進行全波長掃描，結果如圖4（a）所示。從掃描結果可以看出，有兩個峰值，說明色素成分不是單一的，但在波長為495 nm時得到最大吸收峰。為了進一步對色素的成分進行分離，本研究利用高效液相色譜對紅色素進行分離，結果如圖4（b）所示。

圖4 紅色素的全波長掃描及高效液相色譜分離Fig.4 Whole wavelength scanning and HPLC of red pigment

2.5 理化因素對紅色素穩定性的影響

用蒸餾水將發酵液適當到其吸光度范圍在0.3～0.8之間，進而對稀釋后的色素進行pH值、溫度、光照時間、氧化還原性等性質進行穩定性檢測。以上理化因素對紅色素穩定性的影響如圖5所示。

圖5 理化因素對色素穩定性的影響Fig.5 Effects of physical and chemical factors on pigment stability

2.5.1 pH 值對色素穩定性的影響

pH值對色素穩定性的影響如圖5（a）所示，在pH值為5.5時，測得的OD值最高。但值得注意的是，在強酸（pH1.34）和強堿（pH11.71）的條件下，該色素的吸收分別達到最大吸收峰的74.83%和76.44%，說明該色素具有很好的酸堿穩定性。

2.5.2 溫度對色素穩定性的影響

將色素置于不同溫度下處理30min，測定其在495 nm下的吸光值，結果如圖5（b）所示。雖然隨著溫度的升高，測得的吸光值有所下降，但整體的下降速度和下降幅度并不大。當溫度從20℃升高的100℃時，色素的吸光值從0.74下降到0.62，下降幅度僅為16.2%。因此，該色素具有較好的熱穩定性，可適用于溫度較高的環境。

2.5.3 光照對色素穩定性的影響

將色素分別置于自然光和紫外線下處理不同時間，測定其在495 nm下的吸光值，結果如圖5（c）所示。隨著光照時間的增加，色素溶液OD值略微減小，但與對照相比，6 h內色素的OD值下降并不顯著。這說明該色素在自然光和紫外線的照射下，含量穩定。

2.5.4 氧化劑、還原劑對色素分解的作用

將色素分別置于不同濃度的過氧化氫和亞硫酸鈉溶液中處理2 h，測定其在495 nm下的吸光值，結果如圖5（d）所示。在低濃度的過氧化氫溶液中，該色素溶液的OD值就迅速下降，隨著過氧化氫濃度的增加，OD值進一步下降。在較低亞硫酸鈉溶液中，色素的OD值就明顯下降，但隨著亞硫酸鈉的濃度進一步升高，色素的OD值保持穩定。這可能是因為該紅色素不是單一的成分，而是含有多種色素，其中的一種或者多種色素對過氧化氫和亞硫酸鈉較為敏感。

3 結論與討論

雖然真菌色素種類很多，但真正具有商業化價值的色素較少，尤其食品和化妝品行業對新型天然色素的需求仍然較大。三孢布拉霉是工業上生產番茄紅素的主要菌種，菌落呈黃色或者紅色，所產生的番茄紅素是一種脂溶性的胞內色素，具有抗氧化、抗衰老等生理功能。而從三孢布拉霉污染平板上分離得到的這株霉菌無論從菌落形態還是所產色素，都與原菌大為不同。經鑒定，該菌株為產紫踝節菌（T.purpurogenum）。踝節菌屬（Talaromyces）是 1955年 Benjamin將青霉屬（Penicillium）中的部分菌株歸類后定義的，現在產紫踝節菌（T.purpurogenum）在命名上仍與產紫青霉（P.purpurogenum）同用[8]。該真菌不僅能夠產生天然紅色素[9]，還能夠產生木聚糖酶、纖維素酶等[10-11]，在生物技術領域具有重要作用。已報道的該真菌所產的色素為紅曲色素的氨基衍生物PP-V[（10Z）-12-carboxyl-monascorubramine][12]，但并沒有關于該色素功能的研究，并且本研究所獲得的色素從液相圖譜看，其出峰時間與常用的色素番茄紅素、紅曲紅胺均不同，但是否為PP-V目前還不確定。未來需要對該色素進行進一步鑒定。

相比三孢布拉霉等菌株，產紫踝節菌在用于色素的生產具有諸多優勢，如營養需求簡單，生長速度快，不易受到污染，色素產量高等。三孢布拉霉的培養需要正、負兩種菌株同時存在才能大量合成色素，并且菌絲濃度高、需氧量高，在放大培養過程中產量急劇下降[6，13]。而產紫踝節菌僅需要一種菌就能合成大量的紅色素，培養更容易，產量更穩定。另外，產紫踝節菌產生的色素為胞外產物，色素產量提升潛力大，而且也降低了提取成本。作為水溶性的紅色素，不僅具有廣泛的應用范圍，而且在提取過程中不需要使用有機溶劑，即節約成本，又減少了環境污染[14]。因此，無論是菌株還是所產的紅色素，都比三孢布拉霉和番茄紅素更易于工業化。該紅色素的穩定性結果表明，一般的理化因素對其影響不大，但氧化劑和還原劑對其有一定的降解作用。這說明該紅色素雖然不及番茄紅素的抗氧化性強，但可能也具有一定的抗氧化性，并且性質更穩定，更適用于產品的著色劑等。然而，該紅色素的結構和功能，以及該產紫踝節菌是否產生有毒代謝產物還需進一步的鑒定，實現商業化生產仍需更多的研究。

綜上所述，本研究從三孢布拉霉污染平板上分離得到了一株能夠產生水溶性紅色素的霉菌，經鑒定，該真菌為產紫踝節菌。菌株在生長的穩定期（48 h發酵）產生紅色素，到發酵第120 h產量最大。紅色素經過水提取后，在495 nm處具有最大吸收峰，經液相色譜分析，該紅色素為復合色素，由4種以上的單色素組成，但與目前常用的番茄紅素、紅曲紅胺等在液相色譜中的出峰時間均不同；該色素具有對紫外線等光照不敏感，耐高溫、在強酸和強堿條件下都具有很好的穩定性，并且為胞外水溶性分泌物，因此具有很好的開發價值。但需要進一步對其生理功能、結構以及毒性進行深入研究。

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