定量分析癌胚抗原的諧振式無(wú)線生物傳感器*

黎穎茵， 孫 浩， 左兆瑞， 毛紅菊， 錢大宏

0 引 言

癌胚抗原(carcino-embryonic antigen,CEA)濃度可以作為良性與惡性腫瘤的鑒別依據(jù)[1～5]。臨床上常用的檢測(cè)手段中[6～8]，酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)靈敏度低，而其他方法雖然檢測(cè)靈敏度高，但需要特殊的儀器設(shè)備，成本高，難以對(duì)臨床樣本進(jìn)行快速、簡(jiǎn)便、低廉的檢測(cè)。無(wú)線傳感技術(shù)具有成本低、便于批量化制備、操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，在通信、半導(dǎo)體、機(jī)械等領(lǐng)域已經(jīng)得到廣泛應(yīng)用，但在生物檢測(cè)方面的應(yīng)用國(guó)內(nèi)鮮有報(bào)道[9～12]。

本文提出了一種新型的諧振式無(wú)源無(wú)線生物傳感器，根據(jù)不同濃度的CEA抗原改變叉指電極的電容值引起帶寬值發(fā)生變化，通過(guò)電感線圈互感耦合的方式讀取傳感器信號(hào)，實(shí)現(xiàn)快速檢測(cè)CEA抗原的濃度，從而為良性與惡性腫瘤的判斷提供簡(jiǎn)便的檢查方式，實(shí)現(xiàn)即時(shí)檢驗(yàn)的功能。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 試劑和耗材

CEA，癌胚抗原的特異性抗體(anti-CEA)，癌胚抗原量子點(diǎn)抗體(anti-CEA二抗)均購(gòu)自上海領(lǐng)潮生物科技有限公司。(3-氨丙基)三乙氧基硅烷(3-aminopropyltriethoxysilane,APTES)、戊二醛(glutaraldehyde,GLU)和光敏苯并環(huán)丁烯(benzocyclobutene，BCB)購(gòu)自Sigma公司。10 mmol/L的磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline,PBS)(pH值為7.2±0.1)購(gòu)自杭州吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司。食人魚(piranha)溶液為濃硫酸(H2SO4)和30 %過(guò)氧化氫(H2O2)的混合物(體積比7︰3)。在實(shí)驗(yàn)中，所購(gòu)買的化學(xué)試劑和化學(xué)用品均可直接使用，無(wú)需純化。所有的溶液配制均采用18 MΩ的MilliQ凈化系統(tǒng)制備的超純水。

1.2 諧振式無(wú)線傳感器制備工藝

無(wú)線傳感器包含叉指電極和電感線圈2個(gè)部分，制作工藝流程為：

1)清洗石英片:將石英片浸沒(méi)在濃硫酸和雙氧水的混合溶液中(兩者比例約為10︰1)加熱清洗直到溶液中的氣泡消失，再依次放入到丙酮/乙醇/去離子水中分別進(jìn)行超聲清洗，用干燥潔凈的氮?dú)獯蹈伞?/p>

2)勻膠光刻:在石英片表面旋涂光刻膠，通過(guò)曝光與顯影在襯底表面光刻出金屬電極的圖形。

3)金屬蒸發(fā):通過(guò)電子束蒸發(fā)在襯底表面沉積10 nm厚的鈦膜和200 nm厚的金膜。

4)金屬剝離:將輪廓以外的金屬剝離，完成金屬電極和電感的初步制作。

5)再一次光刻，涂覆BCB，厚度為6 μm，顯影后280 ℃固化3 h。

6)為了橋接電感和電極，重復(fù)步驟(2)～步驟(5)，在兩者之間制作第二層金屬,得到無(wú)線傳感電極基底。

1.3 無(wú)線生物傳感器的修飾制備

無(wú)線生物傳感器的制備通過(guò)表面化學(xué)修飾的方法完成，具體修飾過(guò)程為：

1)清洗電極基底：為了去除電極表面存在的有機(jī)物，將電極依次浸泡在丙酮、無(wú)水乙醇、piranha溶液和氫氧化鈉溶液中，最后用去離子水沖洗干凈，在空氣中晾干。

2)硅烷化處理：在將生物分子固定于相鄰電極之間的間隙里之前，電極間隙需進(jìn)行硅烷化處理。將潔凈干燥的電極進(jìn)行等離子體(Plasma)處理；將電極基底浸入含4 % APTES的無(wú)水乙醇溶液中；用無(wú)水乙醇清洗，120 ℃加熱固定。

3)活化處理：將經(jīng)過(guò)硅烷化處理的電極基底在戊二醛的水溶液中活化1 h后，用去離子水沖洗干凈。

4)交聯(lián)抗體：在電極表面加入0.1 mg/mL鼠抗人Anti-CEA抗體溶液，于37 ℃孵育2 h，使抗體分子通過(guò)戊二醛的交聯(lián)作用固定在電極間隙;在牛血清蛋白(bull serum albumin,BSA)溶液中封閉1 h;固定好抗體的電極用去離子水清洗干凈后在4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

5)孵育抗原:配制所需濃度的抗原溶液，加入到已經(jīng)固定好抗體的電極上，于37 ℃孵育2 h，用PBS沖洗未結(jié)合的抗原;氮?dú)獯蹈?，?zhǔn)備電學(xué)測(cè)試。

1.4 腫瘤標(biāo)志物的電學(xué)檢測(cè)

電極上制備的單層電容電感(LC)諧振電路與讀取器構(gòu)成無(wú)線信號(hào)讀取單元。讀取設(shè)備由連接兩匝線圈天線的矢量網(wǎng)絡(luò)分析儀組成。傳感器系統(tǒng)電容電感值的變化轉(zhuǎn)換為諧振點(diǎn)頻率特性(即帶寬)的變化。頻率范圍設(shè)置為10 MHz～1 GHz，每次測(cè)試重復(fù)3次，取平均值。

2 結(jié)果與討論

2.1 無(wú)線生物傳感器的檢測(cè)原理

利用普通光學(xué)顯微鏡觀察叉指電極的結(jié)構(gòu)，無(wú)源無(wú)線生物傳感器主要由單層電感線圈L和叉指電容器C串聯(lián)組成，外部讀出系統(tǒng)主要由矢量網(wǎng)絡(luò)分析儀和測(cè)試線圈組成，如圖1(a)所示。測(cè)量時(shí)，將生物傳感器靠近測(cè)試線圈，矢量網(wǎng)絡(luò)分析儀輸出交流信號(hào)施加在測(cè)試線圈上，通過(guò)與生物傳感器上的LC諧振回路的電感線圈L互感耦合完成傳遞能量和信號(hào)。電極表面結(jié)合的癌胚抗原改變了傳感器的參數(shù)，使傳感器的復(fù)阻抗發(fā)生變化，從而改變傳感器的帶寬值。因此，傳感器帶寬的變化可以用于表征與傳感器結(jié)合的癌胚抗原的濃度，實(shí)現(xiàn)癌胚抗原的無(wú)線無(wú)源檢測(cè)。

該無(wú)線傳感器的等效電路圖如圖1(b)所示。其中L2為傳感器線圈的電感量，R2為線圈的電阻值。C2為叉指電極的電容值，RC為叉指電極的介質(zhì)損耗電阻值。L1為測(cè)試線圈的電感量，R1為測(cè)試線圈的電阻值。生物傳感器的諧振頻率f的表達(dá)式為

(1)

圖1 無(wú)線生物傳感器的測(cè)量過(guò)程

傳感器諧振回路的帶寬(bandwidth,B)通過(guò)在不同的驅(qū)動(dòng)頻率下測(cè)量復(fù)阻抗變化得到，而帶寬的變化能夠反映傳感器系統(tǒng)結(jié)合的癌胚抗原的濃度。觀察無(wú)線生物傳感器的阻抗譜，可知復(fù)阻抗最大值對(duì)應(yīng)的頻率為傳感器的諧振頻率，通過(guò)計(jì)算-3 dB處的頻率范圍可以得到傳感器的帶寬為

(2)

2.2 修飾方法的表征結(jié)果

傳感器電極表面經(jīng)過(guò)硅烷化、活化處理之后，加入量子點(diǎn)Anti-CEA抗體(一抗)，觀察其是否能夠牢固連接到電極表面。在熒光顯微鏡下電極間隙出現(xiàn)分布均勻明亮的綠色熒光條帶，驗(yàn)證了Anti-CEA抗體能夠均勻修飾到傳感器電極表面。另外，電極經(jīng)活化處理，并在孵育Anti-CEA一抗和CEA抗原之后，再加入量子點(diǎn)Anti-CEA(二抗)鑒定CEA抗原的特異性，觀察CEA抗原抗體特異性結(jié)合的情況。熒光顯微鏡下可以看到免疫反應(yīng)區(qū)域出現(xiàn)均勻明顯的紅色熒光條帶，驗(yàn)證了與Anti-CEA一抗結(jié)合的是CEA抗原，排除了非特異性結(jié)合的干擾。上述結(jié)果表明：在該傳感器電極表面不僅Anti-CEA抗體能夠連接到電極表面，且CEA抗原能夠和固定在電極上的Anti-CEA抗體特異性結(jié)合。證明電極上進(jìn)行的抗原抗體特異性結(jié)合免疫反應(yīng)有效可行。

2.3 腫瘤標(biāo)志物的檢測(cè)效果

將空載電極連接到矢量網(wǎng)絡(luò)分析儀進(jìn)行掃頻測(cè)試，得到空載狀態(tài)的帶寬值。在傳感器修飾制備過(guò)程中，加入戊二醛、Anti-CEA一抗、10 ng/mL CEA抗原溶液后分別進(jìn)行掃頻測(cè)試，觀察傳感器系統(tǒng)諧振時(shí)帶寬的變化。如圖2所示，在電極上修飾不同物質(zhì)，所對(duì)應(yīng)的帶寬值變化顯著。隨著電極表面修飾的生物化學(xué)物質(zhì)越多，帶寬值變化越大。也就是說(shuō)，傳感器表面狀態(tài)的細(xì)微變化就能引起傳感器系統(tǒng)電容值的變化，使得諧振點(diǎn)的頻率特性也隨之改變。因此，該傳感器能夠靈敏地檢測(cè)出不同的修飾狀態(tài)，能夠檢測(cè)出傳感器系統(tǒng)細(xì)微的變化，具有良好的靈敏度。

圖2 實(shí)驗(yàn)過(guò)程的帶寬值變化

配制濃度梯度為1,10,100,1 000 ng/mL的CEA抗原溶液，與固定在電極上的Anti-CEA抗體進(jìn)行特異性結(jié)合反應(yīng)后傳感器系統(tǒng)的響應(yīng)如圖3所示。

圖3 帶寬值隨不同濃度CEA抗原的響應(yīng)變化曲線

可見(jiàn)，隨著CEA抗原濃度的增加，帶寬值也不斷增大，且存在很強(qiáng)的相關(guān)性，線性擬合得到相應(yīng)的回歸方程為帶寬值B=4.526 67×106×lg(CEA抗原濃度)+7 433 333.35，相關(guān)系數(shù)R2=0.994 59。該傳感器有較廣的適用濃度檢測(cè)范圍，初步檢測(cè)到CEA抗原濃度范圍為1～1 000 ng/mL，最低檢測(cè)濃度為1 ng/mL，具有良好的適用性。

3 結(jié)束語(yǔ)

本文提出了一種基于互感耦合無(wú)線檢測(cè)的叉指電極生物傳感器。通過(guò)微機(jī)電系統(tǒng)技術(shù)制備得到該傳感器的叉指電容和耦合線圈結(jié)構(gòu)，利用戊二醛交聯(lián)共價(jià)修飾方法在傳感器電極表面連接上Anti-CEA抗體，通過(guò)抗原抗體特異性結(jié)合的免疫反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)了對(duì)CEA抗原的特異性和高靈敏檢測(cè)。該傳感器可以為腫瘤標(biāo)志物的即時(shí)檢驗(yàn)提供依據(jù)和可行性。

參考文獻(xiàn):

[1] Adam J K,Odhav B,Bhoola K D.Immune responses in cancer[J].Pharmacology & Therapeutics,2003,99(1):113-132.

[2] Hammarstr?m S.The carcinoembryonic antigen(CEA) family:Structures,suggested functions and expression in normal and malignant tissues[J].Seminars in Cancer Biology,1999,9(2):67-81.

[3] 李永慶，尚培中，苗建軍,等.晚期直腸癌患者支架治療檢測(cè)癌胚抗原表達(dá)的臨床意義[J].中國(guó)現(xiàn)代普通外科進(jìn)展，2009(8):726-727.

[4] 肖亮生，黃江玲，邱少雄,等.CA153和CEA檢測(cè)在三陰乳腺癌中的應(yīng)用價(jià)值[J].廣東醫(yī)學(xué)，2013 (13):2029-2031.

[5] 易 琳，劉興明，林 丁,等.血清CA153、CA125、CEA聯(lián)合檢測(cè)在乳腺癌診斷中的價(jià)值[J].重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2012 (9):802-805.

[6] 謝躍文，王 強(qiáng)，夏 潔.電化學(xué)發(fā)光和酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)癌胚抗原和甲胎蛋白結(jié)果分析[J].國(guó)際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2011(2):255-256.

[7] 程克文，潘道東，騰 軍,等.免標(biāo)記型生物傳感器比色法快速檢測(cè)癌胚抗原[J].核農(nóng)學(xué)報(bào)，2017 (9):1782-1787.

[8] 李偶連，劉 翠，童艷麗,等.癌胚抗原(CEA)檢測(cè)技術(shù)的研究進(jìn)展[J].現(xiàn)代醫(yī)學(xué)儀器與應(yīng)用，2008 (2):48-51.

[9] 鄧森洋，張萬(wàn)里，彭 斌,等.時(shí)域加窗技術(shù)改進(jìn)無(wú)源無(wú)線SAW傳感器測(cè)試研究[J].傳感器與微系統(tǒng)，2015，34(3):8-10.

[10] 孫啟永，張 文，李海波,等.基于微電極陣列和無(wú)線傳感器網(wǎng)絡(luò)的水環(huán)境重金屬檢測(cè)系統(tǒng)研究[J].傳感技術(shù)學(xué)報(bào)，2013(7):907-911.

[11] 張 波，府偉靈，毛瓊國(guó),等.基于壓電諧振檢測(cè)技術(shù)的癌胚抗原免疫傳感器的實(shí)驗(yàn)研究[J].生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)雜志，2006(4):708-712.

[12] 盧蔚君，惠 春，徐愛(ài)蘭.新型檢測(cè)癌細(xì)胞的諧振式生物傳感器[J].傳感器與微系統(tǒng)，2006,25(3):65-67.