乙型肝炎病毒蛋白及環(huán)氧合酶在乙肝相關性肝細胞癌發(fā)展與轉(zhuǎn)移中的作用

殷 駿 周秀敏

(蘇州大學附屬第一醫(yī)院，江蘇 蘇州 215000)

乙型肝炎病毒持續(xù)感染是肝癌發(fā)生的重要原因〔1〕。乙型肝炎病毒X蛋白在乙型肝炎病毒持續(xù)感染小鼠模型致癌過程中具有重要生物學意義〔2〕；環(huán)氧合酶(COX)基因為可誘導表達基因，其中同工酶COX-2可被多種細胞外刺激后誘導表達，與腫瘤發(fā)生、發(fā)展密切相關〔3〕。本研究擬分析乙型肝炎病毒X蛋白、COX-2在人乙肝相關性肝細胞癌發(fā)展與轉(zhuǎn)移中的作用機制。

1 材料與方法

1.1材料與試劑 53例人肝細胞癌組織源于2014年5月至2016年6月蘇州大學附屬第一醫(yī)院手術切除的病理標本，其中乙型肝炎病毒 cccDNA陽性為乙型肝炎相關性肝癌組織，陰性為非乙型肝炎相關性肝癌組織。人肝癌細胞系HepG2、HepG2-X購于中國科學院。主要試劑：DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購于北京北方同正生物技術發(fā)展有限公司；乙型肝炎病毒X蛋白鼠抗人單抗、COX-2鼠抗人單抗、CD34鼠抗人單抗購于上海聯(lián)碩生物科技有限公司；NMLV逆轉(zhuǎn)錄酶購于上海經(jīng)科化學科技有限公司。

1.2免疫組織化學 SP法檢測人肝細胞癌組織中乙型肝炎病毒X蛋白、COX-2、CD34的表達水平。鼠抗人乙型肝炎病毒X蛋白、COX-2單抗滴度均為1∶800，鼠抗人CD34單抗滴度為1∶200，磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗為陰性對照。半定量積分法判斷陽性表達，細胞膜、細胞質(zhì)、細胞核被深成棕黃色為陽性，細胞核藍色為陰性；Werdner法計算微血管密度。

1.3細胞培養(yǎng)和計數(shù) 人肝癌細胞系HepG2、HepG2-X細胞加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，放入37℃ 5%CO2的培養(yǎng)箱中。每12 h觀察1次，待細胞貼壁后更換含COX-2抑制劑西樂葆(0、20、40、60 μmol/L)的細胞培養(yǎng)基，細胞活性染料臺盼藍染色細胞計數(shù)，記錄HepG2、HepG2-X細胞生長情況。

1.4RT-PCR檢測COX-2 mRNA表達 分別取1×106個轉(zhuǎn)染X基因的HepG2-X細胞及空載體轉(zhuǎn)染的對照HepG2細胞，使用Trizol試劑盒提取細胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA并進行PCR擴增，正向引物：5′-AAGTTTACTAACACCCTTTTA-3′，反向引物：5′-TCTAGTAGACGGACTCTATAG-3′；引物設計由上海吉然生物科技有限公司完成。反應條件：70℃ 20 min，94℃ 60 s，55℃ 45 s，72℃ 60 s，共30個循環(huán)。擴增產(chǎn)物行電泳檢測，分析灰度值，與β-actin的比值為相對表達量。

1.5Western印跡檢測COX-2蛋白表達 細胞覆蓋面積占培養(yǎng)皿75%～80%時用PBS洗滌細胞，冰上收集細胞后用RIPA裂解，4℃ 10 000 r/min離心20 min，收集上清液蛋白，常規(guī)行蛋白定性、定量、電泳。十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)分離蛋白后濕法轉(zhuǎn)膜，室溫下用10%脫脂奶粉封閉1 h，滴加COX-2單抗和β-actin，4℃孵育過夜；滴加辣根過氧化酶(HRP)標記的羊抗鼠二抗，室溫下孵育4 h，洗膜后ECL顯色。

1.6酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法檢測細胞上清液中PGE2 將1×106個細胞平鋪到24孔板中，培養(yǎng)至貼壁75%～80%融合時收集細胞培養(yǎng)上清液，胰酶消化培養(yǎng)板中的細胞，顯微鏡下計數(shù)，作為PGE2水平參照。使用ELISA試劑盒，檢測樣品均設置3個復孔，進行PGE2水平測定。

1.7統(tǒng)計學分析 采用SPSS20.0 軟件行t檢驗、χ2檢驗及Spearman相關分析。

2 結 果

2.1人肝細胞癌組織中乙型肝炎病毒X蛋白、COX-2的表達 42例乙型肝炎相關性人肝細胞癌組織中乙型肝炎病毒X蛋白陽性表達率為76.19%(32/42)，以細胞質(zhì)陽性表達為主且呈棕黃色。COX-2陽性表達率為83.33%(35/42)，以細胞質(zhì)與細胞膜陽性表達為主且呈棕黃色。32例乙型肝炎病毒X蛋白陽性表達組織中COX-2陽性率為87.50%(28/32)，明顯高于陰性表達組織中的30.00%(3/10)和非乙型肝炎相關性肝癌組織中的45.45%(5/11)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，見圖1。

2.2微血管密度計數(shù) CD34抗體多陽性表達于毛細血管內(nèi)皮細胞核，呈棕黃色表達，見圖2。

圖1 乙型肝炎病毒X蛋白、COX-2在人肝細胞癌組織中的表達(×200)

圖2 CD34在早期和進展期人肝細胞癌組織中的表達(×200)

32例乙型肝炎病毒X蛋白陽性表達組織中微血管密度平均計數(shù)為(51.56±9.14)；其中11例早期癌癥組織中微血管密度為(43.18±10.62)，21例進展期癌癥組織中微血管密度為(57.81±18.42)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。10例乙型肝炎病毒X蛋白陰性表達組織中微血管密度為(34.28±2.81)，明顯低于陽性表達組織；28例COX-2陽性表達組織中微血管密度為(56.61±3.58)，明顯高于COX-2陰性表達組織的(33.62±2.83；P<0.01)。非乙型肝炎相關性肝癌組織中微血管密度為(34.95±1.79)，明顯低于乙型肝炎病毒X蛋白陽性表達組織及COX-2陽性表達組織(P<0.01)。乙型肝炎病毒X蛋白陰性表達組織和COX-2陰性表達組織之間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。相關性分析顯示，乙型肝炎病毒X蛋白、COX-2與肝細胞癌組織微血管生成呈正相關(r=0.671，P<0.01)。

2.3HepG2、HepG2-X細胞生長和藥物抑制情況 臺盼藍染色細胞計數(shù)顯示，培養(yǎng)1～5 d HepG2細胞數(shù)分別為：1.12×104、3.65×104、6.17×104、7.83×104、9.67×104；HepG2-X細胞數(shù)分別為：1.09×104、4.81×104、8.35×104、11.06×104、15.92×104。結果顯示，HepG2-X細胞在10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中生長比HepG2細胞快。20、40、60 μmol/L COX-2抑制劑西樂葆對HepG2細胞生長抑制率分別為：(4.61±1.08)%、(10.83±3.67)%、(42.69±8.55)%；HepG2-X細胞生長抑制率分別為：(7.38±2.15)%、(22.05±6.13)%、(64.18±9.91)%。結果顯示，西樂葆對HepG2、HepG2-X細胞生長抑制呈劑量依賴性且HepG2-X細胞更為敏感。

2.4HepG2、HepG2-X細胞中COX-2 mRNA和蛋白表達情況 HepG2-X細胞中COX-2 mRNA的相對表達量為(6.51±0.79)，明顯高于HepG2細胞的(4.05±0.42)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；HepG2-X細胞中COX-2蛋白相對表達量為(9.82±1.36)，明顯高于HepG2細胞的(3.68±0.82)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。見圖3。

圖3 COX-2 mRNA和蛋白表達情況的RT-PCR和Western印跡檢測結果

2.5西樂葆作用后細胞中COX-2表達情況及細胞上清培養(yǎng)液中PGE2水平 60 μmol/L的COX-2抑制劑西樂葆作用72 h后HepG2-X、HepG2細胞中COX-2 mRNA的相對表達量分別為(2.15±0.58)、(1.95±0.43)，均較西樂葆作用前的(6.38±0.56)、(4.41±0.37)明顯降低，其中HepG2-X下降幅度更為明顯，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。西樂葆作用后HepG2-X、HepG2細胞中COX-2 蛋白的相對表達量分別為(2.49±0.61)、(1.53±0.38)，均較西樂葆作用前的(10.05±1.82)、(3.81±0.76)明顯降低，其中HepG2-X下降幅度更為明顯，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。見圖4。

1作用前HepG2-X細胞；2作用前HepG2細胞；3作用后HepG2-X細胞；4作用后HepG2細胞圖4 西樂葆作用前后HepG2-X、HepG2細胞中COX-2蛋白表達情況

60 μmol/L西樂葆作用72 h后HepG2-X、HepG2細胞培養(yǎng)上清液中PGE2水平分別為(513.68±72.15)pg/ml、(639.51±58.09)pg/ml，較作用前的(1 967.85±207.18)pg/ml、(1 304.61±196.50)pg/ml明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

3 討 論

乙型肝炎病毒X蛋白表達使肝癌產(chǎn)生獨特的生物學特征，與肝細胞癌的發(fā)生、進展、轉(zhuǎn)移密切相關。新生血管是腫瘤生長、轉(zhuǎn)移過程中的必要因素，COX-2對腫瘤組織新生血管生成具有明顯促進作用，其表達水平與腫瘤組織浸潤、轉(zhuǎn)移呈正相關。動物試驗發(fā)現(xiàn)，在乙型肝炎相關性肝癌中，乙型肝炎病毒X蛋白可活化T細胞核因子，進而與COX-2啟動子結合后使其表達上調(diào)，促進癌細胞侵襲〔4〕。乙型肝炎病毒X蛋白和COX-2在肝細胞癌組織中的協(xié)同表達提示COX-2可能是乙型肝炎病毒X蛋白的一個作用靶點。

PEG2是COX-2的主要代謝產(chǎn)物，腫瘤組織中PEG2水平明顯高于正常組織且COX-2與PEG2可促進癌細胞生長和血管生成〔5〕。COX-2/PEG2可通過激活AKT信號通路促進人肝癌細胞生長〔6〕。本研究結果提示，乙型肝炎病毒X蛋白可能通過相應的信號通路活化COX-2表達，進而激活其下游產(chǎn)物PEG2發(fā)揮促進肝細胞癌發(fā)展與轉(zhuǎn)移。提示乙型肝炎病毒X蛋白對COX-2表達的影響不僅是數(shù)量的改變，更是功能性的改變。

4 參考文獻

1方宏罡,董秀鵬.慢性乙型肝炎白介素18及其結合蛋白與乙型肝炎病毒DNA載量的相關性〔J〕.中國老年學雜志,2015;35(14):3953-5.

2劉海鷗.乙型肝炎病毒大S蛋白(LHBs)和X蛋白(HBx)對肝癌發(fā)生的轉(zhuǎn)移的調(diào)控及其功能的研究〔D〕.上海：復旦大學,2012.

3Xirong L,Rui L,Xiaoli Y,etal.Hepatitis B virus can be inhibited by DNA methyltransferase 3a via specific zinc-finger-induced methylation of the X promoter〔J〕.Biochemistry(Mosc),2014;79(2):111-23.

4Luo L,Chen S,Gong Q,etal.Hepatitis B virus X protein modulates remodelling of minichromosomes related to hepatitis B virus replication in HepG2 cells〔J〕.Intern J Mol Med,2013;31(1):197-204.

5董小鋒.Meloxicam通過COX-2依賴及非依賴途徑發(fā)揮其抗肝細胞肝癌機理的研究〔D〕.濟南：山東大學,2014.

6Wu CY,Cheng HY,Oil KL,etal.Real-time sensing of hepatitis B virus X gene using an ultrasensitive nanowire field effect transistor〔J〕.J Polymer Engin,2014;34(3):273-7.