運動干預延緩骨骼肌衰老的作用及機制

張麗麗

(湖州師范學院，浙江 湖州 313000)

隨著年齡增加，骨骼肌結構和功能會發生退行性變化，加速了心血管、神經、內分泌系統及其他組織器官的衰老〔1〕。因此，從骨骼肌衰老問題著手緩解整個機體衰老具有重要意義。研究發現，將中青年大鼠GDF11蛋白基因敲除后骨骼肌出現類似衰老大鼠的特征〔2〕，提示GDF11蛋白與骨骼肌衰老存在關聯。研究已證實，骨骼肌減少具有可訓練性〔3〕，但其內在機制仍需探討，運動訓練與老齡骨骼肌組織中GDF11蛋白表達的相關性鮮有報道。本次研究探索不同參數的間隙式負重運動對老齡骨骼肌衰老的影響，并分析與骨骼肌組織中GDF11蛋白表達的相關性，探討運動干預骨骼肌減少的可能機制。

1 材料與方法

1.1動物與分組 SPF級雄性Wistar大鼠24只，17月齡，體重(450±20)g，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司。溫度(24±2)℃、相對濕度40%～60%條件下分籠喂養，4只/籠，自由飲水。適應性喂養1 w后稱量體重，隨機數字法分對照組(不進行任何運動干預)、低負重組、中等負重組、高負重組，每組6只。

1.2訓練方法 首先進行無負重適應性訓練7 d，各運動組大鼠參加，跑臺速度設定為10 m/min，30 min/d，坡度0°。之后進行負重適應性訓練7 d，各運動組大鼠參加，跑臺設置與無負重適應性訓練相同，30 min/d，在腰背部捆綁條形負荷，負重為最大負重強度的10%；最大負重強度獲取方法：逐漸在大鼠腰背部增加重量，到無法正常行走為止。正式負重訓練：各運動組大鼠進行為期8 w的負重訓練，低負重組(40%最大負重)、中等負重組(60%最大負重)、高負重組(70%最大負重)，跑臺速度設定為15 m/min，坡度0°，跑3 min、休息3 min，每次共訓練6組，1次/d，周日休息。

1.3標本采集與處理 正式負重第8周結束后，大鼠禁食、禁水12 h，稱重后取股直肌組織標本。腹腔注射50 mg/kg劑量的1%戊巴比妥鈉全麻后，取左側中段股直肌為骨骼肌標本，剔去周圍脂肪，4℃蒸餾水中洗凈，液氮凍干，-80℃保存待測。

1.4骨骼肌形態學觀察及勻漿指標測定 取部分骨骼肌組織，冷凍切片，常規行蘇木素-伊紅(HE)染色，光學顯微鏡下觀察切片，分析各組大鼠骨骼肌形態學改變。分別取各組大鼠骨骼肌組織300 mg，勻漿后使用脂褐質檢測試劑盒(熒光比色法)測定脂褐質含量，使用鈣檢測試劑盒(甲基麝香草酚藍比色法)測定組織中鈣含量，上述操作均按試劑盒說明進行。

1.5Western印跡檢測骨骼肌組織中GDF11蛋白表達 分別取各組冷凍骨骼肌組織20 mg，加RIPA蛋白裂解液后冰上勻漿，離心取上清，使用二喹啉甲酸(BCA)蛋白測定試劑盒檢測抽提蛋白的濃度；行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳，將靶向蛋白濕法轉移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜，室溫下5%脫脂奶粉封閉2 h，滴加GDF11單抗隆抗體(1∶500)，4℃孵育過夜，滴加HRP標記的二抗(1∶1 000)，室溫下孵育3 h，二氨基聯苯胺(DAB)顯色試劑盒處理，電化學發光(ECL)顯色液曝光，凝膠成像系統拍照，以β-actin為內參，分析各條帶灰度值。

1.6統計學分析 采用SPSS20.0軟件行t檢驗。

2 結 果

2.1各組大鼠行為表現及體重變化 大鼠實驗前精神狀態良好，飲水、飲食積極；訓練初期各負重組大鼠飲水、飲食積極性欠佳，隨著時間延長逐漸增加，最終明顯高于對照組；中等及高負重組大鼠訓練間隙和訓練后均表現出程度不同的疲勞現象，但次日訓練時均已恢復正常，低負重組大鼠疲勞現象不明顯。運動后，各負重組大鼠精神狀態明顯優于對照組，表現為對外界刺激反應靈敏度更高，自主活動較多。訓練前各組大鼠體重差異無統計學意義(P>0.05)；經6 w訓練后各負重組大鼠體重均明顯低于訓練前和對照組(P<0.05)，其中以高負重組最明顯。見表1。

表1 各組大鼠訓練前后體重比較

與訓練前相比:1)P<0.05；與對照組相比:2)P<0.01

2.2各組大鼠骨骼肌組織形態學變化 HE染色顯示，各組大鼠骨骼肌纖維組織均出現不同程度的圓形化，細胞排列錯亂且大小不一，細胞間隙增大，可見白色組織填充；其中以對照組大鼠最明顯，高負重組次之，低、中負重組較另外兩組細胞排列更緊密；中、高負重組大鼠部分肌細胞的直徑較大。見圖1。

圖1 各組大鼠骨骼肌組織形態(HE，×400)

2.3各組大鼠骨骼肌勻漿脂褐質及鈣濃度水平比較 對照組與高負重組、低負重組與中等負重組之間脂褐質濃度比較差異均無統計學意義(P>0.05)；低負重組與中等負重組的脂褐質濃度明顯低于對照組與高負重組(P<0.05)。各負重組大鼠骨骼肌中鈣濃度均明顯高于對照組(P<0.05)，其中以低負重組鈣離子濃度升高最明顯。見表2。

表2 6 w訓練后各組大鼠骨骼肌勻漿脂褐質及鈣濃度水平比較

與對照組相比：1)P<0.01

2.4各組大鼠骨骼肌GDF11蛋白表達情況 對照組、低負重組、中等負重組、高負重組大鼠骨骼肌GDF11蛋白相對表達量分別為2.61±0.58、4.70±0.81、4.53±0.69、2.45±0.86，其中對照組與高負重組、低負重組與中等負重組之間比較差異均無統計學意義(P>0.05)；低負重組與中等負重組GDF11蛋白表達水平明顯高于對照組和高負重組(P<0.01)。見圖2。

圖2 各組大鼠骨骼肌GDF11蛋白Western印跡電泳圖

3 討 論

相關研究發現，間隙運動對心肌具有保護作用，還可促進骨骼肌能量供應〔4〕。考慮到本實驗中使用的老齡大鼠心肺功能存在衰退，故選用跑3 min、休息3 min的間隙訓練方式；同時經預實驗確定大鼠最大負重水平，并分別給予40%、60%、70%最大負重反映不同負荷強度。運動前后對大鼠行為表現觀察顯示，間隙負重運動干預可緩解自然衰老進程，增強神經肌肉功能活性水平，其中低負重組大鼠改善更明顯，提示40%最大負重是老年大鼠較為合適的運動刺激。

正常衰老過程中，體內細胞需對抗自由基損傷、病原菌入侵等各種外界刺激；細胞膜為第一道屏障〔5〕。本次研究中老年大鼠骨骼肌纖維組織出現了不同程度的圓形化，可能為細胞膜受外界刺激導致的結果；細胞間隙增大，有白色組織填充可能為老齡骨骼肌中積累的脂肪填充效果。經間隙負重運動干預后，低負重組和中等負重組大鼠骨骼肌纖維組織圓形化程度明顯降低，細胞排列更緊密，提示骨骼肌細胞間隙脂肪含量明顯降低，且未對肌纖維組織造成過度損傷，延緩了正常衰老進程；而高負重組肌細胞間隙脂肪含量增多，可能由于運動強度過大對骨骼肌細胞造成了損傷；此外，中、高負重組大鼠肌細胞直徑變大，說明該運動強度可刺激部分肌纖維增粗。

脂褐質是體內不飽和脂肪酸對抗自由基損傷時生成的產物，可作為反映組織衰老的標志物〔6〕。本實驗結果提示40%和60%最大負荷量間隙運動可促進骨骼肌內自由基清除速率，進而降低脂褐質水平，延緩骨骼肌衰老；而70%負荷間隙運動屬于超負荷，對骨骼肌自由基代謝產生了負面影響。鈣是骨骼肌活動的主要耦聯因子，微量的鈣元素由胞外流入胞內即可對骨骼肌纖維產生明顯影響〔7〕。老齡大鼠因肌肉自身結構改變引發胞內鈣虧空，對胞外鈣的依賴性更高，若未得到有效補充，會加速肌肉衰退〔8〕。本實驗顯示，各負重組骨骼肌中鈣濃度均明顯高于對照組。說明負重間隙運動可動員更多胞外鈣，刺激機體為骨骼肌分配更多的鈣量來保證較好的運動功能，延緩骨骼肌衰老。GDF11蛋白是胞外鈣流入胞內的重要調控蛋白之一，可促進胞外鈣內流；同時GDF11蛋白對維持骨骼肌正常解剖結構具有重要意義。本實驗顯示，低、中等負重組GDF11蛋白水平明顯高于高負重組和對照組，可能與低、中負重強度的運動刺激對老年大鼠較適宜，可直接或間接誘發骨骼肌組織中GDF11蛋白增多；同時還可負向影響骨骼肌收縮機制，導致GDF11蛋白代謝減慢。

4 參考文獻

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