miR-196a高表達在腎臟損傷中作用的分子生物學機制

李慧聰

(河南大學淮河醫院，河南 開封 475000)

慢性腎臟損傷中腎小管間質纖維化是共同病理特征，在原發性或繼發性腎臟疾病中，腎小管間質纖維化程度是決定腎功能惡化水平的主要因素〔1〕。因此，早期抑制或逆轉腎小管間質纖維化對延緩腎臟損傷向終末期發展具有重要意義。腎間質肌成纖維細胞是構成胞外基質的主要細胞，腎小管上皮間充質轉分化是病理狀態下肌成纖維細胞增多的主要機制之一〔2，3〕。相關研究顯示，腎小管間質纖維化過程中腎小管上皮間充質轉分化發揮重要作用，該過程在一定條件下具有可逆性〔4〕。但目前腎小管間質纖維化的相關調控機制仍未明確，尚缺少有效的干預靶點。近年來研究發現miR-196a不僅對肝癌、胰腺癌等癌細胞具體調控作用，其高表達還可誘導腎小管上皮間充質轉分化〔5，6〕；蛋白二硫化物異構酶(PDI)A3是調控人線粒體氧化應激的主要蛋白之一，前期生物信息學篩選發現PDIA3可能為miR-196a的直接靶基因。本研究旨在驗證miR-196a與PDIA3的互補配對關系，探討miR-196在腎小管間質纖維化過程中的作用機制。

1 材料與方法

1.1材料與試劑 人腎小管上皮細胞(HKC) 購于上海匹拓生物科技有限公司；清潔級ICR小鼠，7～9周齡，體質量24～27 g，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司。DMEM培養基、胎牛血清購于北京雅安達生物技術有限公司；轉化生長因子(TGF)-β1購于江蘇凱基生物技術股份有限公司；兔抗人α-血管平滑肌肌動蛋白(SMA)單克隆抗體、兔抗人PDIA3/ERp57多克隆抗體購于上海信裕生物科技有限公司、LNA修飾的anti-miR-196a、pre-miR-196a購于廣州賽誠生物科技有限公司。

1.2體外細胞學實驗

1.2.1細胞培養與分組 將HKC細胞株接種到含10%胎牛血清的DMEM培養液中，CO2孵箱中常規培養。驗證miR-196a是否參與調控腎小管上皮間充質轉分化的實驗分組：常規培養組、TGF-β1組(5 ng/ml TGF-β1處理HKC細胞)、anti-miR-196a+TGF-β1組(LNA修飾的anti-miR-196a寡核苷酸200 nmol/L轉染HKC細胞24 h)。PDIA3為miR-196a對應靶基因驗證實驗分組：對照組(常規培養)、pre-NC組、anti-NC組、pre-miR-196a組、anti-miR-196a組、TGF-β1組、pre-NC+TGF-β1組、anti-NC+TGF-β1組、pre-miR-196a+TGF-β1組、 anti-miR-196a+TGF-β1組。

1.2.2Western印跡檢測 離心收集各組細胞并提取總蛋白，定量后取50 μg行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳，濕法轉膜；室溫孵育60min、洗膜、電化學發光(ECL)顯影。一抗為兔抗人α- SMA 單克隆抗體(1∶200)、兔抗人PDIA3/ERp57多克隆抗體(1∶500)、鼠抗人β-actin(1∶1 000)；二抗為辣根過氧化物酶(HRP)標記的兔抗鼠抗體(1∶500)。

1.3體內動物實驗

1.3.1小鼠單側輸尿管梗阻模型建立與分組 小鼠常規適應性喂養7 d，全麻后鈍性游離左側輸尿管和腎臟，對左側輸尿管近腎盂端行結扎術；假手術組僅鈍性游離左側輸尿管。隨機分為：5 mg/kg及10 mg/kg干預組(輸尿管結扎前30 min，經尾靜脈注射劑量為5、10 mg/kg LNA修飾的anti-miR-196a寡核苷酸)，陰性對照組(注射劑量為10 mg/kg LNA修飾的anti-negative-miR-196a)，模型組、假手術組、空白對照組，每組各5只。

1.3.2腎臟組織學檢查 腎組織經10%甲醛固定后用石蠟包埋，3 μm切片、常規蘇木素-伊紅(HE)染色。半定量標準進行腎小管間質損傷、腎小球硬化評分，高倍鏡視野下選取20個無遮蓋皮質視野，依據腎小管間質損傷面積評分：0分(正常)、1分(損傷面積<10%)、2分(10%～25%)、3分(26%～50%)、4分(51%～70%)、5分(>70%)。每張切片觀察30個腎小球，依據硬化灶所占總面積比評分：0分(無病變)、1分(損傷面積<25%)、2分(25%～50%)、4分(51%～70%)、5分(>70%)，計算腎小球硬化指數。

1.3.3qRT-PCR檢測miR-196a表達 提取小鼠腎組織標本總RNA，反轉錄得到cDNA，使用KAPA SYBR FAST 1-Step試劑盒進行檢測，反應體系25 μl，反應條件：95℃ 2 min、95℃ 20 s、60℃ 15 s、72℃ 10 s，循環40次。miR-196a特異性擴增引物由廣州賽誠生物科技有限公司設計完成。

1.3.4免疫組化檢測 SP法分析各組小鼠腎小管上皮間充質轉分化相關標志物〔α-SMA、波形蛋白(Vimentin)〕、PDIA3、硫氧還原蛋白(Trx)的表達水平。方法為：3 μm腎組織切片，微波修復抗原20 min，分別加入抗α-SMA(1∶100)、抗Vimentin(1∶100)、抗PDIA3(1∶200)、抗Trx(1∶150)，4℃孵育過夜，加二抗、室溫孵育30 min，二氨基聯苯胺(DAB)顯色、蘇木素復染20 s，脫水、透明、中性樹脂封片，用Image J軟件進行半定量分析。

2 結 果

2.1miR-196a誘導腎小管上皮間充質轉分化的細胞學研究 體外細胞實驗顯示，5 ng/ml的TGF-β1能夠上調miR-196a表達并誘導腎小管上皮細胞發生上皮間充質轉分化。TGF-β1組細胞中α-SMA表達量為1.75±0.32，明顯高于常規培養組的1.12±0.10，差異有統計學意義(P<0.05)。anti-miR-196a+TGF-β1組α-SMA表達量為1.43±0.32，明顯低于TGF-β1組(P<0.05)。

2.2PDIA3為miR-196a對應靶基因 pre-miR-196a組細胞中PDIA3蛋白表達量為0.35±0.06，明顯低于pre-NC組的0.81±0.09(P<0.05)；anti-miR-196a+TGF-β1組PDIA3蛋白表達量為0.75±0.06，明顯高于anti-NC+TGF-β1組的0.39±0.04(P<0.05)；表明PDIA3為miR-196a對應靶基因。見圖1。

1為對照組；2a為pre-NC組，2b為anti-NC組；3a為pre-miR-196a組，3b為anti-miR-196a組；4為TGF-β1組；5a為pre-NC+TGF-β1組，5b為anti-NC+TGF-β1組；6a為pre-miR-196a+TGF-β1組，6b anti-miR-196a+TGF-β1組圖1 各組PDIA3蛋白的Western印跡電泳圖

2.3小鼠梗阻側腎臟病理學改變 模型組和陰性對照組小鼠腎小管間質損傷、腎小球硬化評分均明顯低于假手術組和空白對照組(P<0.01)；5、10 mg/kg干預組腎小管間質損傷評分明顯低于模型組和陰性對照組(P<0.05)，其中以5 mg/kg干預組逆轉腎小管間質纖維化作用更明顯。見表1、圖2。

2.4各組小鼠梗阻側腎組織miR-196a表達情況 模型組小鼠梗阻側腎組織miR-196a相對表達量為7.15±1.76，明顯高于假手術組的0.67±0.29(P<0.01)；5、10 mg/kg干預組小鼠梗阻側腎組織miR-196a相對表達量為3.14±0.61、4.36±3.72，明顯低于模型組(P<0.05)。

2.5腎臟組織免疫組化檢測 5、10 mg/kg干預組 α-SMA、Vimentin相對表達量明顯低于模型組、陰性對照組(P<0.05)；5、10 mg/kg干預組 PDIA3蛋白表達明顯高于模型組、陰性對照組(P<0.05)；5、10 mg/kg干預組間比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表1 各組小鼠腎組織損傷評分比較分，n=5)

與陰性對照組、模型組比較：1)P<0.05,2)P<0.01;下表同

圖2 各組小鼠腎組織病理學改變(HE染色，×400)

表2 各組小鼠腎組織α-SMA、Vimentin、PDIA3相對表達量比較

2.6miR-196a抑制腎組織抗氧化應激反應 以Trx為抗氧化應激標志物，免疫組化檢測顯示，模型組小鼠腎組Trx表達量0.17±0.10，明顯低于假手術組和空白對照組的0.75±0.16、0.69±0.13(P<0.05)；5、10 mg/kg干預組Trx表達量0.42±0.16、0.34±0.20，明顯高于模型組和陰性對照組0.17±0.10、0.15±0.08(P<0.05)。

3 討 論

miRNA可通過對靶mRNA的修飾來調控細胞多種生物學行為〔7〕。在miRNA調控腎小管上皮間充質轉分化的研究中，證實了miR-196a表達隨腎小管上皮細胞上皮間充質轉分化的發生而明顯上調，當抑制miR-196a表達后可部分逆轉腎小管上皮間充質轉分化現象。體內動物實驗提示阻斷miR-196a表達可部分逆轉腎小管間質纖維化，但非劑量依賴性。

miRNA的生物學效應主要通過調控下游靶基因來實現〔8〕，前期生物信息學篩選發現參與細胞抗氧化應激的PDIA3是miR-196a預測靶基因之一；進一步行體外細胞學實驗發現，轉染pre-miR-196a可明顯抑制HPTC細胞中PDIA3蛋白表達量，轉染anti-miR-196a可有效逆轉TGF-β1誘導的PDIA3表達下調。小鼠體內實驗中行5 mg/kg anti-miR-196a干預后，梗阻側腎組織中PDIA3蛋白表達上調，纖維化程度較模型組明顯減輕，提示PDIA3為miR-196a對應靶基因，二者具有互補效應。PDIA3是調控人線粒體氧化應激的主要蛋白之一，本實驗選取Trx為抗氧化反應指標，結果發現PDIA3表達下調的同時伴隨著Trx表達下降，抑制miR-196a表達后，PDIA3表達上調的同時Trx也相應升高；提示出現腎小管間質纖維化時PDIA3表達下調并伴有腎組織抗氧化應激能力減弱，抑制細胞抗氧化應激是miR-196a參與腎臟損傷的重要機制之一。

4 參考文獻

1石 晶,曹 喆,賈 琳.p66shc基因表達與老年糖尿病患者早期腎損傷的相關性〔J〕.中國老年學雜志,2017;37(3):603-5.

2許昌海,金紅旭.持續性腎臟替代聯合血必凈對膿毒癥患者炎癥反應、免疫功能的影響〔J〕.中國衛生工程學,2016;15(5):499-500.

3周學萍,汪正光,張牧城,等.老年重癥患者急性腎損傷的高危因素〔J〕.中國老年學雜志,2016;36(6):1435-8.

4Yang C,Jia Y,Zhao T,etal.Naked caspase 3 small interfering RNA is effective in cold preservation but not in autotransplantation of porcine kidneys〔J〕.J Surg Res,2013;181(2):342-54.

5許昌海,金紅旭.持續性腎臟替代聯合血必凈對膿毒癥患者炎癥反應、免疫功能的影響〔J〕.中國衛生工程學,2016;15(5):499-500.

6陳小英,賈海紅,李曉麗.NGAL和血清胱抑素C在預測妊高征腎臟損傷中的診斷價值〔J〕.北華大學學報(自然科學版),2016;17(5):648-51.

7楊 偉.EGCG對順鉑誘導大鼠腎損傷的保護作用及相關機制研究〔D〕.錦州：錦州醫科大學,2016.

8劉遠輝.miRNA-20a靶向Atg7影響的自噬對造影劑誘導的急性腎損傷的機制研究及新的急性腎損傷危險因素探討〔D〕.廣州：南方醫科大學,2016.