hRAMP1基因修飾BMSCs對心臟的保護作用及其機制

許官學 王正龍 趙然尊 龍仙萍 陳文明 石 蓓

(遵義醫學院附屬醫院心血管內科，貴州 遵義 563003)

急性心肌梗死(AMI)是臨床常見的急危重癥，患者易發生心力衰竭，預后差，嚴重影響患者生命質量〔1〕。骨髓間充質干細胞(BMSCs)是一種具有自我增殖和多種分化潛能的干細胞〔2〕，目前在細胞治療、組織和器官修復等方面呈現出巨大優勢。近年來，通過干細胞移植重建損毀心肌顯示良好的應用前景。研究表明，人受體活性修飾蛋白(hRAMP)1基因修飾間充質干細胞(MSC)可以有效改善梗死后心臟功能及促進損傷血管內皮修復〔3〕。本研究主要觀察hRAMP1基因修飾的BMSCs在血管內皮細胞定向分化及其對心功能的保護作用。

1 材料和方法

1.1實驗動物 新西蘭大白兔購自遵義醫學院科學實驗動物中心。

1.2主要儀器試劑 增強型綠熒光蛋白報告基因(EGFP)、hRAMP1基因重組腺病毒載體，均由本課題組完成構建；胎牛血清(FBS)、L-DMEM培養基、胰蛋白酶購自美國Gibco公司；兔骨髓淋巴細胞分離液購自北京Mairybio，戊巴比妥鈉為美國Sigma公司；血小板-內皮細胞黏附分子CD29、CD31、CD45、CD90多克隆抗體為英國Abcam公司；兔血管內皮生長因子(VEGF)和核因子(NF)-κB酶聯免疫吸附(ELISA)檢測試劑盒購自上海西唐生物科技公司；倒置熒光顯微鏡為日本Nikon Ti-S；流式細胞儀為BD FACSCalibur。

1.3實驗方法

1.3.1BMSCs分離與培養 以3%戊巴比妥鈉(30 mg/kg)對新西蘭兔進行麻醉，無菌條件下抽取骨髓3～4 ml。用等體積磷酸鹽緩沖液(PBS)混勻稀釋，1 000 r/min離心5 min，棄上清及脂肪層，留細胞懸液。將其緩慢加到等體積兔淋巴細胞分離液中，2 000 r/min離心18 min，分離、收集單個核細胞(BMNCs)。將收集到的BMNCs重復洗滌2次，以DMEM培養基，37℃、5%CO2飽和濕度培養箱中進行原代培養。10 d左右，當細胞鋪瓶底滿80%～90%，用0.25%胰蛋白酶消化后制成細胞懸液，以一傳二的形式進行傳代。后續正式實驗使用第3～4代細胞。

1.3.2BMSCs鑒定 應用BD流式細胞儀，以CD29-異硫氰酸熒光素(FITC)、CD45-藻紅蛋白(PE)、CD90-PE熒光染料標記的抗體鑒定BMSCs。將1.0×106個培養BMSCs用PBS制成單細胞懸液，設置對照組、CD29-FITC+CD45-PE組和CD90-PE組；3組相應加入兔免疫球蛋白(Ig)G-FITC 10 μl、鼠抗兔CD29-FITC和CD45-PE抗體各10 μl、鼠抗兔CD90-PE抗體10 μl，后置于暗處避光反應30 min，1 200 r/min，離心5 min后收集細胞沉淀。使用無菌1×PBS重懸細胞，上機檢測并分選、計數表面陽性標記細胞。

1.3.3腺病毒載體構建和轉染 構建Ad-EGFP-hRAMP1和Ad-EGFP重組腺病毒載體，并通過RT-PCR、Western印跡及測序鑒定。取第3代BMSCs，以1×105個/ml接種6孔板，37℃、5%CO2培養箱中孵育，當瓶底細胞密度為70%～80%，更換無血清培養基，參考預實驗轉染條件，病毒Ad-EGFP-hRAMP1按照復感染指數(MOI=800)轉染BMSCs。轉染后培養6 h，吸棄培養液，PBS洗孔板一次，加入含10%FBS培養基3 ml/孔，繼續于37℃、5%CO2培養箱中孵育。實驗設計24 h、48 h及72 h 3個時間節點，在熒光倒置顯微鏡下對轉染情況進行觀察，計數200個細胞中綠色熒光染色細胞數，觀察并估計轉染效率。將轉染細胞消化離心，經1×PBS沖洗兩遍后制備密度為1×105個/ml細胞懸液，應用流式細胞儀檢測培養BMSCs的轉染率。

1.3.4心肌梗死再灌注模型建立 實驗新西蘭兔按照1 ml/kg量經由耳緣靜脈注射3%戊巴比妥鈉進行麻醉，于胸骨左緣第2～4肋間斷肋，游離肋間組織。暴露心包膜、充分暴露心臟，于左心耳下方5～10 mm處用6.0號丙烯線予貫穿持續結扎左室支90 min，心臟再灌注恢復后關閉胸腔。觀察模型建立情況。

1.3.5轉染BMSCs和細胞移植 移植前3 d，按照復感染指數(MOI=800)加入Ad-EGFP-hRAMP1和Ad-EGFP重組腺病毒，轉染BMSCs。轉染3 d后消化BMSCs細胞，制備細胞懸液密度為1.0×108個/ml，行耳緣靜脈移植，實驗設置Ad-EGFP-hRAMP1-BMSCs(hRAMP1-BMSCs組)、Ad-EGFP-BMSCs(BMSCs組)和對照組，每組各6只。

1.3.6ELISA檢測VEGF和NF-κB 用兔耳緣靜脈血2 ml，室溫3 000 r/min離心10 min分離血清，按照試劑盒操作說明測定血清VEGF和NF-κB含量。酶標儀讀取450 nm處樣品吸光度值(OD)，根據標準曲線計算相應VEGF和NF-κB含量。

1.3.7超聲心動圖的檢測 BMSCs移植后28 d，心臟超聲檢測3個連續的心動周期內左心室舒張末徑(LVDd)、左心室收縮末徑(LVSd)、短軸縮短率(LVFS)及左心室射血分數(LVEF)，取平均值。

1.4統計學方法 應用SPSS16.0軟件進行單因素方差分析。

2 結 果

2.1骨髓BMSCs的分離培養、鑒定及細胞轉染 骨髓細胞分離24 h后開始貼壁，由開始多角形或長梭形逐漸變成穩定長梭形，導致顯微鏡下視野呈現成纖維細胞外觀。EGFP標記的重組腺病毒載體成功轉染細胞后，在倒置熒光顯微鏡視野下可見綠色熒光。Ad-EGFP-hRAMP1和Ad-EGFP在轉染BMSCs 72 h后，有大約80%細胞可觀察到綠色熒光。見圖1。

圖1 BMSCs原代培養及細胞轉染

流式細胞術檢測間充質干細胞表面標記CD29、CD45和CD90，結果顯示，有95.79% 呈現出CD29陽性表達，12.49% 有CD45陽性表達，而有98.58%出現CD90陽性表達。

2.2建立新西蘭兔心肌梗死模型評價 實驗新西蘭兔心臟左室支結扎前，正常心肌顏色紅潤，左室支而結扎90 min后心肌逐漸變為蒼白色。心電圖測定顯示，結扎后與結扎前相比ST段弓背向上抬高，提示已成功建立心肌缺血再灌注模型。兔心肌梗死模型建立28 d，制備心肌組織切片并進行蘇木素-伊紅(HE)染色，可見正常的新西蘭兔心肌纖維排列整齊有序，中央為心肌纖維細胞核；梗死的新西蘭兔的心肌纖維排列紊亂，細胞核多數出現溶解，并見少量中性粒細胞浸潤，同時多數梗死區膠原纖維演變為瘢痕組織。見圖2。

圖2 新西蘭兔心肌梗死模型評價

2.3移植BMSCs向損傷血管歸巢并分化為血管內皮細胞 以心肌缺血再灌注實驗動物模型手術損傷側血管和未損傷側血管作比較，發現BMSCs移植后損傷側血管腔面可觀察到綠色熒光標記，而對側未損傷血管則無綠色熒光出現。經過TRITC標記的CD31表達處會呈現出紅色熒光。與冰凍切片同一視野比較發現，對照組增生內膜中無CD31和EGFP的表達；血管增生內膜有CD31和EGFP表達，結果提示，重組腺病毒載體成功轉染至BMSCs內，結合到損傷部位后定向分化促進血管內皮的生成。見圖3。

A、C：hRAMP1-BMSCs組，B、D：對照組圖3 細胞移植28 d BMSCs歸巢至損傷的血管并分化為血管內皮細胞(×400)

2.4VEGF和NF-κB血清學檢測 心肌梗死后28 d，與對照組比較，BMSCs組及hRAMP1-BMSCs組VEGF表達均顯著增高(P<0.01)，NF-κB水平顯著下降(P<0.01)；與BMSCs組比較，hRAMP1-BMSCs組VEGF表達顯著增高，NF-κB水平顯著下降(均P<0.01)。見表1。

表1 各組VEGF和NF-κB表達水平及心臟超聲檢測結果比較

與對照組比較：1)P<0.01；與BMSCs組比較：2)P<0.01

2.5各組心臟超聲檢測結果比較 與對照組比較BMSCs組LVDd、LVDs均降低，LVFS、LVEF均增加，但差異無統計學意義(均P>0.05)；hRAMP1-BMSCs組LVDd和LVDs均顯著降低(P<0.01)，LVFS和LVEF均顯著增加(P<0.01)。

3 討 論

AMI是冠狀動脈閉塞至心肌急性、持續性缺血缺氧及壞死，常伴有血清心肌酶活性增強并伴有進行性心電圖動態變化，甚至可并發心律失常，引起休克或心力衰竭。盡管經皮冠狀動脈介入治療(PCI)能顯著改善AMI患者的預后，然而PCI術后患者出現的血管再狹窄，仍是目前面臨的瓶頸，而促進損傷血管快速再內皮化，防止血管再狹窄是改善AMI心功能的重要策略及環節。本課題組前期研究表明，單純BMSCs移植一定程度上能夠通過自身的分化為內皮細胞或通過旁分泌機制促進損傷動脈的內皮修復，降低血管再狹窄風險，但效果并不十分理想〔4〕。降鈣素基因相關肽(CGRP)是生物學方法發現的第一種活性多肽，由37 個氨基酸組成，與其受體結合后，可通過升高腺苷酸環化酶(cAMP)，發揮內源性擴血管活性〔5，6〕。CGRP受體包含受體活性修飾蛋白(RAMP)-1和降鈣素受體樣受體(CRLR)亞單位。研究顯示，CGRP在心血管系統具有擴血管、抑制血管平滑肌細胞增殖、參與血管損傷內皮修復等活性〔7，8〕，而RAMP-1則是CGRP執行生物學功能的關鍵。研究表明，CGRP與其受體結合后可抑制梗死區域局部NF-κB介導趨化性因子的產生〔9〕，其機制可能為通過BMSCs分化為血管內皮細胞并參與血管生成。本研究結果表明，BMSCs移植可促進血管內皮細胞分化并參與兔心肌梗死模型損傷血管生成，有利于缺血組織再血管化。本研究結果提示，hRAMP1基因修飾的BMSCs移植后可以更好地減輕AMI后由于心室重構導致的心功能降低，加強對延緩或阻止左室重構的發展及對心功能的保護作用。基于上述本研究結果，推測其機制可能為，hRAMP1修飾可能增強CGRP活性或調節旁分泌效應分泌促血管生成因子〔10～12〕，如一氧化氮(NO)、VEGF、NF-κB等，有利于心肌梗死區血管內皮細胞的生成及損傷血管內皮的修復，調節BMSCs移植后梗死區域局部微環境，改善心功能保護心臟。綜上，本研究顯示，hRAMP1修飾的BMSCs移植后可誘導BMSCs向損傷血管歸巢，并可定向分化為血管內皮細胞，且對延緩或阻止左室重構及心功能保護具有積極作用。

4 參考文獻

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