Aβ42介導的阿爾茨海默病對小腦AMPA受體GluR2亞基及caspase-3表達的影響

趙 明 閆 雷 龔守良 隋汝波

(錦州醫科大學附屬第一醫院神經內科，遼寧 錦州 121001)

DepartmentofNeurology,theFirstAffiliatedHospitalofJinzhouMedicalUniversity,Jinzhou121001,Liaoning,China

【Abstract】ObjectiveTo study the effect of neurotoxicity mediated byβ-amyloid protein 42(Aβ42) on expressions of cerebellar AMPA receptor (AMPAR) GluR2 subunit and caspase-3 protein and gene.MethodsAlzheimer′s disease (AD) animal model was prepared by intracerebroventricular injection of Aβ42 (5 μl), and water maze test was used to screen and enroll SD rats. Samples were randomly divided into control (intracerebroventricular injection of 5 μl saline) and Aβ42 intracerebroventricular injection group, and the expressions of GluR2 subunit, caspase-3 protein and gene of cerebellum AMPAR were detected by immunohistochemical staining, Western blot and RT-PCR.ResultsThe expressions of GluR2 subunit gene and protein in the Aβ42 intracerebroventricular injection group were significantly lower than those of control group (P<0.05). while the expression of caspase-3 was significantly higher than that of control group (P<0.05), and the results of Western blot were consistent with the results of RT-PCR.ConclusionsNeurotoxicity mediated by Aβ42 affects the expressions of GluR2 subunits and caspase-3 in cerebellar AMPAR, and AMPAR participates in the neurotoxicity mediated by Aβ42 in the cerebellum of rats with AD via caspase-3.

【Keywords】 Alzheimer′s disease; β-amyloid 42 (Aβ42); Cerebellum; AMPAR; Caspase-3

有研究顯示，小腦作為神經系統的一部分，不僅在運動方面起作用，其在認知功能、自主神經系統及邊緣系統中同樣起重要作用〔1〕。學習記憶能力受多種因素調控，目前關于突觸可塑性及神經遞質的研究較多，長時程增強(LTP)和長時程抑制(LTD)是兩種主要類型的突觸可塑性功能〔2〕。小腦浦肯野細胞層高表達α-氨基-3-羥基-5-甲基-4-異惡唑丙酸(AMPA)受體(AMPAR)〔3〕，而AMPAR誘導LTP/LTD的形成是學習記憶的重要模型〔4〕。AMPAR是由4種不同基因編碼的亞基組成，即谷氨酸受體(GluR)1、2、3和4，其中GluR2亞基由于其mRNA Q/R位點編輯引起的低Ca2+通透性，使其在AMPAR中的相對含量決定了AMPAR的功能特性。β-淀粉樣蛋白(Aβ)由39 ～ 43個氨基酸組成，其二聚體是最小的突觸毒性物質，是引起阿爾茨海默病(AD)的重要物質。Aβ可被蛋白酶作用而分解為氨基酸的殘基亞型，其中最常見的是Aβ40和Aβ42，后者與AD病情相關。本研究探討Aβ42介導的AD對小腦AMPAR的GluR2亞基及含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(caspase)-3表達的影響。

1 材料與方法

1.1動物與分組 實驗動物是由中國北京維通利華實驗動物技術有限公司提供的SPF級8周齡雄性SD大鼠24只，體重220～260 g，隨機分為對照組和Aβ42組。許可證號：SCXK(京)NO11400700058126。

1.2造模方法 Aβ42組每隔1 d給予80 μmol/L Aβ42 5 μl側腦室注射；對照組每隔1 d側腦室注射5 μl生理鹽水。17 d后進行水迷宮實驗，取實驗樣品。

1.3主要試劑和儀器 鼠抗GluR2抗體(Sigma P-246)、鼠抗caspase-3抗體(NOVUS NB600-1372)和鼠抗肌動蛋白(actin)抗體(Abcam ab18570)等試劑；倒置顯微鏡(德國 Leica，4 000 b)；雙 臂 小 動 物 腦 立 體 定 位 儀 ( 美 國 Stoelting，51903)；全自動熒光和化學發光成像分析系統(美國UVP，Bio Spectrum 510)。

1.4Morris水迷宮測試 在水迷宮的采集培訓期間，要求大鼠連續5 d找到一個隱藏平臺，第6～8天評估空間學習能力。同時測定大鼠到達平臺的有效路徑。

1.5腦組織取材 每組中任選3只大鼠于10%水合氯醛0.3 ml/100 g腹腔注射麻醉，用4%多聚甲醛緩沖液灌流固定48 h以上，小腦經30%蔗糖沉降48 h后，用冰凍切片機制備18 μm腦組織切片，置于含1%疊氮鈉的磷酸鹽緩沖液(PBS)中4℃保存。用于免疫熒光染色。 分別隨機選擇3只大鼠，麻醉后直接斷頭解剖，收集小腦組織于EP管中，置于-80℃保存，用于Western印跡檢測和PCR檢測。

1.6Western印跡 組織蛋白提取，二喹啉甲酸(BCA)試劑盒蛋白定量，根據所需蛋白分子量大小配制適宜濃度十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)分離膠和濃縮膠，起始加樣孔加5倍重懸緩沖液(RSB)5 μl，按順序向加樣孔中逐個加入20 μl蛋白樣品，剩余空泳道加入5 μl RSB，電泳，轉膜，GluR2、caspase-3抗體孵育，增強電化學發光法(ECL)顯像。

1.7免疫組化熒光顯色 進行小腦冰凍切片(18 μm)，羊血清封閉1 h；Ⅰ 抗：鼠抗GluR2抗體(Sigma P-246)(1∶1 000)；Ⅱ抗：兔抗鼠免疫球蛋白(Ig)G，常規PBS沖洗5 min，共3次，4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染核10 min，甘油封片并鏡檢。

1.8RT-PCR 將裝有組織的EP管至于冰上，向每個EP管中加入1 ml Trizol，混勻，用超聲波破碎儀打碎后，冰浴條件靜止10 min，各加入氯仿0.2 ml，搖勻，冰浴條件靜止10 min，4℃離心15 min，12 000 r/min，取上清液至另一已標記好的EP管中，加入0.5 ml異丙醇，混勻，冰浴條件靜止10 min，4℃離心10 min 12 000 r/min，棄上清液后75%乙醇1 ml洗滌，4℃離心機7 500 r/min離心5 min棄上清液。自然風干5 min。取適量DEPC水加入EP管，溶解RNA，測定RNA樣品濃度。設計引物，反轉錄成cDNA，擴增，上樣、電泳，顯像及條帶分析。

1.9統計學方法 用SPSS19.0軟件行配對t檢驗。

2 結 果

2.1兩組大鼠逃避潛伏期及有效路徑情況比較 連續5 d的訓練大鼠找到隱藏的平臺的時間逐漸縮短，有效路徑顯著增高。第6～8天，Aβ42組大鼠穿過平臺次數百分比〔(24.48±0.29)%〕較對照組〔(32.45±0.48)%〕明顯降低(P<0.05)；Aβ42組穿過平臺次數〔(2.45±0.23)次〕較對照組〔(4.32±0.56)次〕明顯減少(P<0.05)。

2.2兩組GluR2和caspase-3蛋白表達情況比較 Aβ42組GluR2亞基表達水平(0.76 ± 0.80)較對照組(1.03 ± 0.13)明顯減少(P<0.01)。Aβ42組caspase-3表達水平(0.63 ± 0.08)較對照組(0.55 ± 0.78)明顯增高(P<0.05)。見圖1。

2.3兩組GluR2亞基免疫熒光檢測比較 Aβ42組GluR2(8.59±0.88)較對照組(15.53±0.87)表達明顯減少(P<0.05)。見圖2。

2.4兩組GluR2、caspase-3基因表達比較 Aβ42組GluR2基因表達量(1.14 ± 0.18)較對照組(1.55 ± 0.07)顯著減少(P<0.01)。Aβ42組caspase-3基因表達量(0.58 ± 0.11)較對照組(0.43 ± 0.09)顯著增加(P<0.05)。見圖3。

圖1 兩組GluR2和caspase-3蛋白表達

圖2 兩組GluR2免疫組化熒光顯色

圖3 兩組GluR2和caspase-3基因表達

3 討 論

既往小腦被認為AD不被累及的腦組織區域，且在影像學上被作為對照研究。近年來的研究及PET的應用進一步證實小腦并不能作為AD患者的腦組織參考區域〔5〕。也有研究發現，電刺激小腦頂核可改善Aβ42誘導的大鼠空間學習記憶障礙〔6〕。Hu等〔7〕研究發現，具有促進Aβ形成作用的mRNA亞型FE65，在AD患者小腦上表達上調。由此有理由推斷小腦參與了AD病程。

AMPAR是由四聚體構成的離子通道受體，與NMDAR和KAR介導中樞神經系統興奮性突觸傳遞〔8〕。AMPAR介導中樞神經系統快速興奮性突觸傳遞，在突觸后膜的動態表達與LTP和LTD的誘發和維持有關，參與調解學習記憶活動〔9〕。在小腦中，LTD的形成是由于GluR2亞基磷酸化作用導致受體內化，LTP 的形成是由于GluR2的脫磷酸化作用，使GluR2亞基表達于細胞膜表面〔10〕。此外，大部分AMPAR對Ca2+不通透，因為四聚體中含有GluR2亞基受體，然而缺乏GluR2亞基可致Ca2+通透，調節突觸可塑性甚至介導神經毒性〔11〕。本實驗中，Aβ42組GluR2亞基表達量下降可能與GluR2亞基磷酸化導致受體內化有關，而擾亂GluR2亞基的插入和胞吞可致突觸可塑性機制受損及LTP/LTD等突觸可塑性事件發生異常，這與AD早期認知功能障礙存在緊密聯系。另一方面，含GluR2亞基的AMPAR減少，可導致Ca2+內流增加，導致鈣超載。研究表明，AD屬于一種多因素疾病，涉及多種病理機制，最終形成凋亡理論〔12〕。D′Amelio等〔13〕研究發現，caspase-3可早期導致AD小鼠突觸功能喪失。本實驗證實Aβ42組小腦中caspase-3蛋白及基因表達較對照組增高，其可能機制是GluR2亞基下調導致鈣超載。然而，caspase-3是否進一步誘導AMPAR的GluR2亞基表達量下降有待于進一步研究證實。本實驗研究結果主要是在組織水平獲取的，后期實驗可進一步行細胞研究及對GluR2亞基磷酸化水平進行檢測，并對小腦進行形態學監測可更加明確這一觀點。

綜上，本結果表明，側腦室注射Aβ可成功制造AD大鼠模型。AMPAR的GluR2亞基可通過改變AD大鼠小腦LTP/LTD形成導致小腦突觸可塑性發生變化，從而對學習記憶產生影響。GluR2亞基下調的同時導致Ca2+內流，可產生神經毒性，進一步證實小腦參與了AD病程。

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