腦梗死后癲癇與γ-氨基丁酸B受體及前強啡肽原啟動子基因多態性的關系

王 璇 王 辰 秦麗微 秦麗紅

(佳木斯大學附屬第一醫院神經內科，黑龍江 佳木斯 154002)

中國腦梗死繼發癲癇發生率約為15.6%〔1〕。腦內興奮性和抑制性神經遞質失衡是癲癇發病的機制之一，其中γ-氨基丁酸、強啡肽、谷氨酸等神經遞質及受體發揮關鍵作用〔2〕。γ-氨基丁酸B受體基因亞單位(G1465A)和前強啡肽原啟動子區基因多態性與顳葉癲癇相關〔3〕，但具體調控機制及腦梗死繼發癲癇易感基因方面的研究仍鮮有報道。本研究探討腦梗死繼發癲癇患者γ-氨基丁酸B受體基因(G1465A)和前強啡肽原啟動子區基因多態性。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2015年10月至2016年10月佳木斯大學第一附屬醫院收治的腦梗死繼發癲癇患者52例(繼發癲癇組)，腦梗死無癲癇患者81例(無癲癇組)；診斷標準均符合急性缺血性腦卒中診治指南(2014版)，并簽署知情同意書。繼發癲癇組中男28例，女24例，年齡58～85歲，平均(70.61±8.37)歲，近1個月內均未服用抗癲癇藥物，既往無癲癇史和其他顱內疾病。無癲癇組中男45例，女36例，年齡56～87歲，平均(69.35±10.08)歲。選取同期90例體檢正常老年人為健康對照組，其中男49例，女41例，年齡60～85歲，平均(70.28±8.39)歲。三組受試者性別、年齡差異均無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2方法

1.2.1基因組DNA提取 取三組受試者空腹肘靜脈血3 ml，放入抗凝劑預處理的試管中，使用全血基因組DNA小量提取試劑盒(上海索寶生物科技有限公司)，柱層析法提取基因組DNA，-20℃保存待測。

1.2.2γ-氨基丁酸B受體基因(G1465A)基因型檢測 采用PCR-RFLP技術檢測：①PCR反應：上游引物5'-GAACGAT TGCACCCAAACTGG-3',下游引物5'-CTCGTGGCATGAGGTCCGA CC-3'；反應體系30 μl(基因組DNA 0.1～0.2 μl,上游和下游引物各2 μl，2×TaqDNA聚合酶15 μl,雙蒸餾水適量)；常規反應條件下進行40個循環，與末次循環結束后72℃延伸5 min；取產物10 μl,20瓊脂糖凝膠電泳，確定擴增成功。②RFLP檢測：取PCR產物10 μl,雙蒸餾水17 μl,Tango緩沖液(10×)2 μl,EagⅠ1 μl,37℃反應20 h，收集產物5 μl，瓊脂糖凝膠電泳，ChemiDoc MP成像系統中觀察擴增情況。③結果判定：γ-氨基丁酸B受體基因第7外顯子1465位有G-A多態性，當此位為G等位基因時，則有EagⅠ酶切位點；當此位為A等位基因時，則無酶切位點。因此，PCR擴增產物為1個片段(441 bp)為A/A型，3個片段(441 bp、183 bp、258 bp)為A/G型，2個片段(183 bp、258 bp)為G/G型。

1.2.3前強啡肽原啟動子區基因多態性檢測 采用PCR技術檢測：①PCR反應：上游引物5'-TCGTTAGTCT CCAACTTCAACCTGCG-3',下游引物5'- CGTGGTCCGCCAATCCA TCTCCAAGA-3'；反應體系和反應條件同方法1.2.2。②PCR產物電泳和結果判定：取PCR產物10 μl，瓊脂糖凝膠電泳，ChemiDoc MP成像系統中觀察擴增情況。產物片段長度應為：590 bp、522 bp、454 bp、386 bp，含有1～4個拷貝數的重復單位(68 bp)，電泳結果1個條帶的為純合子基因型，2個條帶的為雜合子基因型；等位基因含1～2個拷貝數的為L型，含3～4個拷貝數的為H型。因此，前強啡肽原啟動子區基因可分為：L/L型(1/1、1/2、2/2)；L/H型(1/3、2/3、1/4、2/4)；H/H型(3/3、3/4 、4/4)。

1.3統計學方法 應用SPSS21.0軟件行χ2檢驗。

2 結 果

2.1γ-氨基丁酸B受體(G1465A)基因多態性檢測結果 PCR擴增產物電泳顯示441bp條帶，見圖1。37℃經EagⅠ酶切24 h后電泳僅顯示258 bp和183 bp條帶，見圖2。提示三組受試者γ-氨基丁酸B受體基因第7外顯子1465位均為G等位基因，基因型均為G/G型，無A/A型、A/G型。

1～3 繼發癲癇組，4～5 無癲癇組，6～7 健康對照組；圖2同圖1 γ-氨基丁酸B受體基因PCR擴增產物電泳圖

圖2 γ-氨基丁酸B受體基因PCR擴增產物EagⅠ酶切電泳圖

2.2前強啡肽原啟動子區基因型分布情況 電泳顯示，前強啡肽原啟動子區基因型分別為：L/L型(1/1、2/2)、L/H型(2/3、2/4)、H/H型(3/3)，見圖3。繼發癲癇組患者L/L型頻率明顯高于無癲癇組、健康對照組，H/H型頻率明顯低于無癲癇組、健康對照組(P<0.01)；無癲癇組與健康對照組前強啡肽原啟動子區基因型分布差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

圖3 前強啡肽原啟動子區基因PCR擴增產物電泳圖

表1 三組前強啡肽原啟動子區基因型分布比較〔n(%)〕

與繼發癲癇組相比：1)P<0.01

2.3前強啡肽原啟動子區等位基因頻率分布情況 繼發癲癇組等位基因L型頻率為88.46%(46/52)，明顯高于無癲癇組、健康對照組的14.81%(12/81)、16.67%(15/90)；無癲癇組、健康對照組等位基因H型頻率為85.19%(69/81)、83.33%(75/90)，明顯高于繼發癲癇組的11.54%(6/52)(P<0.01)。無癲癇組與健康對照組前強啡肽原啟動子區基因型頻率差異無統計學意義(P>0.05)。

3 討 論

研究發現，腦梗死后神經遞質γ-氨基丁酸可抑制興奮性氨基酸，減輕缺血造成的神經細胞興奮毒性，而強啡肽原可抑制谷氨酸分泌，抑制神經細胞興奮性，兩者均具有抗驚厥作用〔4〕。已發現的γ-氨基丁酸受體包括A、B、C三種亞型，其中A、B型受體與癲癇發生、發展有明顯關聯〔5〕。γ-氨基丁酸受體基因變異在癲癇發病機制中的作用受到廣泛關注。研究發現，γ-氨基丁酸B受體基因(G1465A)多態性與顳葉癲癇有相關性〔6〕，但之后相關研究結論與其不完全一致〔7〕；且γ-氨基丁酸B受體基因多態性是否與繼發性癲癇發病相關尚未見報道。本研究顯示，三組受試者γ-氨基丁酸受體基因均為G/G型，未發現A/A型、A/G型。其原因可能與人種差異有關，本次受試者均為漢族人群，而該人群中γ-氨基丁酸B受體基因第7外顯子1 465位很少存在G-A突變，并非腦梗死繼發癲癇的易感基因。強啡肽原為另一個抑制性神經遞質，與γ-氨基丁酸具有協同作用。相關研究發現，強啡肽原主要作用于Kappa類阿片受體，且與NMDA受體結合發揮生物學作用，抑制興奮性氨基酸誘發的驚厥〔8〕。前強啡肽是強啡肽原的前體，經酶解可生成強啡肽原。相關研究發現，人強啡肽原基因啟動子區長68 bp重復單元中含有AP-1結合位點，其中AP-1復合物H型等位基因活化后可提升強啡肽原基表達水平，而相同條件下L型等位基因無法活化〔7〕。本次研究提示前強啡肽啟動子區基因型對腦梗死繼發癲癇有明顯影響，其中L型等位基因是繼發癲癇的易感基因，H型等位基因是保護基因。

4 參考文獻

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3Zhou CW,Ding L,Elizabeth Deel E,etal.Altered intrathalamic GABA(A)neurotransmission in a mouse model of a human genetic absence epilepsy syndrome〔J〕.Neurobiol Dis,2015;73:407-17.

4劉志廣.腺苷A1受體在癲癇發病機制中的作用及其與GABA信號通路相關性的研究〔D〕.武漢：華中科技大學,2013.

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6孫柳燕,臧希卉,郭 琪,等.吉林省艾滋病抗病毒治療人群基因型耐藥研究〔J〕.中國衛生工程學,2016;(3):236-9.

7趙 雪,宋文剛,蘭 英,等.脂肪酶產生菌的篩選及基因的克隆表達〔J〕.北華大學學報(自然科學版),2016;17(2):186-90.

8Chowdhury FA,O'Gorman RL,Nashef L,etal.Investigation of glutamine and GABA levels in patients with idiopathic generalized epilepsy using MEGAPRESS〔J〕.J Magn Res Imag,2015;41(3):694-9.