銅對H22荷瘤小鼠腫瘤生長及肝功能和免疫功能的影響

(1 青島大學公共衛生學院，山東 青島 266021； 2 青島市標準化研究院)

銅是一種非常重要的微量元素。它不僅參與蛋白質、核酸、脂肪、碳水化合物、維生素等營養物質的代謝，而且在人體骨骼發育、生殖、凝血等生理功能中起著重要的作用。然而，環境重金屬污染已成為全球問題，環境銅污染也日趨嚴重。銅是工業中常用的重金屬，一項對電子垃圾拆除中心周圍居住人群的血清銅和尿銅的研究檢測結果顯示，暴露組人群和對照組人群的血清銅和尿銅水平均有顯著差異[1]。同時，銅具有的促生長和殺菌作用，使得人們在畜牧業和農業上大量使用銅相關制劑[2-4]。銅蓄積或代謝異常可以導致WILSON病[5]和MENKE病[6]，銅過載與神經性疾病如阿爾茨海默病(AD)等疾病的發生也有關系[7-8]。近年來，隨著腫瘤研究的深入，銅與腫瘤的關系也逐漸成為人們關注的焦點，銅可能是影響人類腫瘤生長的重要因素。臨床流行病學調查顯示，部分癌癥病人血清銅含量明顯高于健康人群，與腫瘤的發生間存在著相關性，如口腔癌、乳腺癌、宮頸癌、肝癌、肺癌和腦瘤等[9-14]，并且適量的銅缺乏是能夠抑制腫瘤發生的[15-16]。本實驗在前期細胞實驗研究的基礎上，通過建立H22荷瘤小鼠的模型，選擇適量的銅濃度給小鼠灌胃，觀察銅對H22荷瘤小鼠腫瘤生長及肝功能和免疫功能的影響。

1 材料與方法

1.1 動物來源及分組

SPF級昆明小鼠80只，體質量18～22 g，購于山東魯抗藥業公司(許可證號scxk(魯)20140007)。適應性喂養1周后，按照體質量隨機分為灌胃給水組(A組)，灌胃給水+四硫鉬酸銨鹽(TM)組(B組)，分別灌胃給予0.06、0.3、1.5 mg/kg硫酸銅組(C、D、E組)，分別灌胃給予0.06、0.3、1.5 mg/kg硫酸銅+1 mg/kg TM組(F、G、H組)，每組10只小鼠，小鼠每日自由進水、進食。

1.2 各組處理與模型制備

根據上述的分組，用不同濃度的硫酸銅溶液給小鼠灌胃4周，使小鼠體內獲得一定量的銅蓄積。隨后，將H22腹水瘤細胞接種于小鼠右腿部，建立H22肝癌小鼠移植瘤模型(抽取H22腹水瘤小鼠的腹水，在顯微鏡下通過錐蟲藍染色計數(>95%)，通過PBS將細胞數調至1×109/L。隨后，以每只5×109個細胞/L接種在小鼠的右后腿)。然后，根據相應的分組及硫酸銅繼續持續灌胃4周。9周后，將全部小鼠處死，眼球取血。取出移植瘤及肝、脾、胸腺等臟器并稱量。

1.3 觀察指標及測定方法

1.3.1腫瘤發生情況及體積變化 在接種腫瘤后，每3 d測量一次腫瘤的長和寬并記錄，根據公式計算瘤體積(V)，公式如下：V=長×寬×寬/2。

1.3.2肝功能及脾臟和胸腺指數計算 實驗結束后，小鼠禁食12 h。眼球取血后，取小鼠的胸腺和脾臟并稱量，通過公式計算出小鼠的胸腺和脾臟指數。公式如下：胸腺指數=胸腺質量/(小鼠體質量×10)，脾臟指數=脾臟質量/(小鼠體質量×10)

1.3.3ICP-MS檢測血清銅的含量 取血清0.2～0.5 g。將試樣置于聚四氟乙烯消解罐中，然后加入6 mL硝酸，再加入1 mL過氧化氫，蓋上密封蓋，放入微波消解儀中消解，程序為升溫至200 ℃，后加熱時間10 min,控制溫度200 ℃，持續時間20 min，冷卻時間30 min。隨后按照儀器操作規程，調整儀器至最佳狀態。待儀器穩定后，按順序依次對標準溶液、空白溶液和試樣進行測定。所得結果按照以下公式進行計算：X=c×10/m×1000 (X:銅含量，c:當前試樣銅濃度，m: 試樣質量)。

1.4 實時熒光定量PCR(Real-time PCR)檢測腫瘤組織中血管內皮生長因子(VEGF)和堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)mRNA的表達

利用Trizol提取腫瘤組織中的mRNA，用痕量核酸儀檢測mRNA的濃度和純度。隨后用逆轉錄試劑盒將mRNA逆轉錄成cDNA，然后用PCR儀檢測VEGF和bFGF的表達。檢測條件如下：95℃預變性5 min；然后95℃變性10 s,60 ℃退火30 s，共進行50個循環。引物序列：bFGF F：5′-ACGG-CTGCTGGCTTCTAAGT-3′，R：5′-CAGTGCCA-CATACCAACTGGA-3′；VEGF F：5′-CACCAAA-GCCAGCACATAGG-3′，R：5′-ACCCTTTCCCTT-TCCTCGAA-3′。

2 結 果

2.1 各組H22荷瘤小鼠體質量及腫瘤的生長變化

實驗結束后，A、B、C組和F組各有1只小鼠死亡，D組中有2只小鼠死亡，E組和H組中有3只小鼠死亡，G組中有4只小鼠死亡。實驗結果顯示，與A、F、G、H組相比，D、E組腫瘤均有不同程度的增長，差異具有顯著意義(F=9.034，P<0.05)。見表1。

2.2 各組小鼠肝功能指標及胸腺、脾臟指數比較

各組小鼠AST、ALT、ALB及胸腺指數、脾臟指數比較，差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

2.3 各組小鼠血清銅水平

A～E組血清銅水平分別為(1.43±0.20)、(1.39±0.17)、(1.55±0.22)、(1.64±0.48)、(1.92±0.27)、(1.51±0.35)、(1.23±0.15)、(1.51±0.35)mg/kg，E組血清銅水平與A組相比顯著增高，差異有顯著性(F=3.803,P<0.05)。

2.4 血清銅與腫瘤質量的相關性分析

隨機抽取32例血清樣本，檢測結果顯示，血清銅的水平平均為(1.51±0.35)mg/kg，腫瘤質量平均為(3.84±1.11)g，血清銅水平與腫瘤質量具有相關性(r=0.316，P<0.05)。

2.5 各組小鼠腫瘤組織中VEGF和bFGF mRNA表達水平比較

A～E組腫瘤組織中VEGF mRNA的相對表達水平分別為0.29±0.004、0.02±0.001、0.26±0.011、0.34±0.012、0.39±0.016、0.06±0.046、0.01±0.001、0.01±0.001；A～E組小鼠腫瘤組織中bFGFmRNA表達水平分別為0.28±0.016、0.02±0.001、0.15±0.007、0.25±0.051、0.92±0.27、0.02±0.014、0.04±0.003、0.01±0.001。C、D、E組與A組相比，腫瘤組織中VEGF和bFGF mRNA表達水平升高，差異有顯著性(F=40.118、197.090,P<0.05)。

表1 各組H22荷瘤小鼠體質量及瘤質量的變化

表2 各組小鼠肝功能指標及胸腺、脾臟指數比較

3 討 論

肝癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一。根據全國第3次死因回顧性調查發現，惡性腫瘤中，原發性肝癌引起的死亡人數已從第3位升高到第2位[17]，嚴重危害著我國居民的健康，給人類造成了巨大的疾病負擔。

肝癌的發生是多因素、多途徑、多步驟長期作用的結果，但病因機制尚未完全闡明，肝癌的預防仍然是臨床上的難題。肝臟作為銅蓄積的主要器官，當銅的蓄積超過肝臟代謝的閾值時，會損害肝細胞，引起多種疾病，如WILSON病[5]和MENKE病[6]。銅過量可引起細胞發生氧化應激，從而產生活性氧(ROS)，ROS可以造成脂質、蛋白質和DNA損傷。ROS同時也是導致腫瘤發生和發展的重要因素[18]。研究顯示，肝對銅負載會啟動自身的保護機制，即使沒有發生臨床、生化和形態上的變化，肝細胞中HGFb和NF-κB的表達也會增加，進而增加肝損傷的風險[19]。以往有關銅的研究多是選擇超過機體可承受范圍多倍的銅濃度，用以觀察高銅對動物的毒性作用；而有關機體可承受的銅濃度對機體的作用主要集中在體外細胞系的研究。但是，人類在現實生活中接觸高濃度銅的機會卻很少。所以本實驗研究所采用的銅和TM的劑量，是根據中國營養學會(CNS)建議的成人銅的適宜攝入量(AI)為2 mg/d，最高可耐受攝入量(UL)為8 mg/d計算出來的。當成人每日攝入0.8～7.5 mg銅時，機體中的血漿銅濃度、紅細胞超氧化物歧化酶、血漿銅藍蛋白和尿銅無明顯變化[20]；當機體攝入1 mL的TM時，可以降低人體20%的血銅，既有效地抑制促血管發生因子的釋放，又不會對機體產生副作用，機體也能長期耐受[21]。本實驗結果顯示，各組小鼠肝功能血清理化指標間比較差異無統計學意義，說明本實驗所選用的銅和TM的濃度在實驗周期內未對小鼠的肝臟和免疫系統造成損傷。

多數腫瘤的生長需要銅離子的參與[22]，長期飲用高銅濃度(公眾供水系統中規定的最高含量)的水能加速癌細胞的生長[23]。這些研究提示，銅可能是影響腫瘤生長的重要因素。腫瘤細胞的高增殖速率相比于正常形態功能的細胞來說，需要更多的銅離子來滿足其對生長、增殖所需的環境條件要求。本實驗結果顯示，隨著銅濃度的升高，H22荷瘤小鼠的腫瘤的大小和體積也隨之增加，呈劑量反應關系；血清銅水平也隨銅濃度的增加而升高，并與腫瘤質量具有相關性，這與銅和乳腺癌關系的研究結果相一致[24]。

腫瘤生長需要許多因素的參與，腫瘤中血管的生成也是腫瘤生長的眾多重要因素之一。腫瘤細胞不僅能夠分泌血管生長因子，而且能夠促進腫瘤血管內皮細胞的增殖。腫瘤血管是由血管生成因子的釋放所介導的，血管生成因子主要包括VEGF、bFGF和TGF等，其中，VEGF是被認為最重要的血管生成因子[25]，VEGF信號通路在血管生成的全過程中發揮不可替代的作用。已有的研究表明，在血管生成的過程中，VEGF通過多種途徑參與腫瘤的生長、轉移等[26-27]。bFGF是最強的腫瘤血管生長因子，其異常表達可促進細胞增殖、惡性轉化以及腫瘤形成[28]。為了深入探討銅和TM對H22移植瘤中VEGF和bFGF的影響，本實驗采用RT-PCR方法檢測了腫瘤組織中VEGF和bFGF mRNA的表達水平，結果顯示，隨著銅濃度的增加，腫瘤組織中VEGF和bFGF mRNA表達有了明顯的上調，而加入TM組腫瘤組織中VEGF和bFGF mRNA的表達逐漸降低。這一結果與RIGIRACCIOLO等[22]的研究一致。

綜上所述，本實驗通過建立H22荷瘤小鼠模型，在銅和TM的作用下觀察腫瘤的生長情況。實驗結果表明，銅能夠促進腫瘤的生長，其機制可能是通過上調腫瘤組織中VEGF和bFGF mRNA的表達，從而達到促進腫瘤細胞增殖的作用，但仍需要進一步的深入研究。本實驗結果為肝癌的預防提供了參考，同時也為防治銅污染提供了證據。

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