SD大鼠死后心血中大腸桿菌DNA含量與早期死亡時間相關性的研究

安志遠，趙攀峰，李 聃，周懷谷，郭育林

（1.上海公安學院，上海200137；2.上海市公安局物證鑒定中心 法醫物證學現場應用技術公安部重點實驗室上海市現場物證重點實驗室，上海200083；3.無錫中德美聯生物技術有限公司，江蘇 無錫214174）

死亡時間（postmortem interval， PMI）的推斷一直是法醫學工作實踐和科研攻關的一項重、難點課題。以往的PMI推斷研究主要聚焦于個體死后尸體現象和尸體內源性物質變化規律，近年來微生物在尸體腐敗過程中的作用成為了一項研究熱點。大腸桿菌（Escherichia coli，E.coli）是人和動物腸道中的正常棲居菌，嬰兒出生后即隨哺乳進入腸道，與人終身相伴。在個體死后，大腸桿菌屬于具有較強分解蛋白質能力的腐敗菌種，且由于其周身鞭毛能運動，最易出現細菌移位（bacterial translocation， BT）[1-3]。故本實驗對SD大鼠心血中大腸桿菌LacZ基因含量的檢測方法及其隨PMI變化的規律進行了一系列初步研究，探討利用心血中LacZ基因含量推斷PMI的可行性。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

EZ1 DNA Investigator Kit（美國 Promega 公司）；Taq DNA 聚合酶（5U/μl，Takara），10×BufferMg2+plus，dNTPs（2.5mM），pMD18-T vector Cloning Kit（寶生物工程（大連）有限公司）引物和Taqman探針（生工生物工程（上海）股份有限公司）；熒光定量PCR儀為ABIPISM-7900HT擴增系統；分光光度計（Thermo Scientific NanoDrop 2000c）；EZ1 Advanced XL（美國Promega公司）。

1.2 方法

1.2.1 大鼠心血DNA樣本采集

18只健康SD大鼠，雌雄不限，體重180～200 g。控制室內環境溫度25℃，適應性飼養3 d頸椎脫位法處死，按PMI隨機分成9組，每組2只，其中1組對照組（死后 0 h），8 組實驗組（PMI分別為：12、24、36、48、60、72、84、96 h），置于密閉室內，分別在各時間點取心血100μL，然后應用EZ1 Advanced XL按照EZ1 DNA Investigator Kit說明書進行操作提取心血DNA，最終每組得到DNA洗脫液100μL，-20℃冰凍保存備用。

1.2.2 菌種獲取

E.coliDH-5α（無錫中德美聯生物技術有限公司）。

1.2.3 引物及探針

在NCBI上獲取已有E.coli的 β-D-半乳糖苷酶合成基因LacZ的序列，選擇較保守的一段序列構建探針及引物體系（表1），設計應滿足以下幾個條件：（1）引物 Tm 值 58～60 ℃；（2）探針 Tm 值 68～70℃；（3）G+C 在 30%～80%之間；（4）引物和探針沒有連續3個以上的堿基G；（5）探針5’端第1個堿基不是 G；（6）探針序列中 C 大于 G；（7）擴增片斷在50～150 bp之間。

表1 大腸桿菌LacZ基因熒光定量PCR引物和探針序列

1.2.4 標準品質粒的制備

選取E.coli的 β-D-半乳糖苷酶合成基因LacZ上大片段克隆引物（LacZ-DF1和LacZ-DR1）（表2），對模板大腸桿菌D-H-5α進行直接擴增獲得PCR產物，經過連接、轉化，篩選出所需菌種，并進行測序比對驗證，證實重組質粒與設計片段的目標序列完全一致，符合設計要求。

表2 大片段克隆引物的寡核苷酸序列

1.2.5質粒濃度測定

將重組質粒提取物以去離子水稀釋，于紫外分光光度計上進行定量，測定其在260nm與280nm的A值，判斷其純度（A260/A280＞1.8為純品）。 取1μL提取質粒，加入 Nano Drop（Thermo）上，測定三次，然后得出質粒濃度（表3）。

1.2.6 線性標準曲線的建立

以提取的LacZ基因克隆轉化菌質粒DNA為模板標準，將其10倍梯度稀釋形成濃度為3.747、0.3747、37.47、3.747、0.3747、0.03747 pg/μL，取各稀釋梯度模板1μL進行熒光定量PCR擴增，反應體系20μL，均為三個復孔，在PCR過程中由實時熒光定量PCR儀自動繪制線性標準曲線（圖1）。

圖1 擴增曲線圖

以克隆質粒模板濃度的對數值為橫坐標，以Ct值為縱坐標建立LacZ熒光定量PCR檢測的標準曲線（圖2）。曲線回歸得標準曲線方程為：Ct=-3.41lgX+25.46（直線斜率 A=-3.41，截距 B=25.46，X 為模板濃度，單位 pg/μL），曲線相關系數r=0.9985，說明標準曲線線性較好。根據A=-1/log（1+E）（E為熒光定量PCR反應的擴增效率），得熒光定量PCR擴增效率為96.34%，符合熒光定量PCR對擴增效率的要求。

圖2 標準曲線線性擬合圖

1.2.7 qPCR擴增體系及程序

用 2×Mastermix10μL、10μM YF1 1μL、10μM YR1 1μL、10μM Taqman 0.4μL、模板 1μL和ddH2O 6.6μL配置成20μL的擴增體系。

設置擴增程序：（1）50℃，持續 2min；（2）95℃，持續 10min；（3）95℃，持續 15 s；（4）60℃，持續 1min；（5）（2）～（4）步驟 40 個循環。

2 結果

2.1 SD大鼠尸體變化

SD大鼠處死后18 h，有輕微異味產生。死后72 h，尸體腹部出現腫脹，口腔開始有腐敗液體流出，臭味明顯，尸體表面可見脫毛現象，腹部有尸綠形成。死后96 h，尸體皮膚下有腐敗靜脈網形成。

2.2 SD大鼠心血DNA樣本的濃度測定

用分光光度法分別測量不同PMI下SD大鼠心血樣本DNA濃度，取1μLDNA樣品，加入Nano Drop（Thermo）上，檢測每組樣本 DNA濃度，取平均值（表 4）。

表3 質粒標準品濃度測定

表4 SD大鼠死后96 h內心血樣本DNA濃度測定

對上述樣本的檢測濃度繪成線性趨勢圖，檢測結果顯示在SD大鼠死后96 h時間段內，死后12 h DNA濃度開始增高，死后60h增速加快，至死后96h達到高峰。對SD大鼠死后96 h心血DNA濃度變化值經過EXCEL軟件相關分析，得出回歸方程式：y=1.0233x+31.647，PMI與DNA濃度的決定系數R2=0.9345，表明DNA濃度隨著PMI的延長而呈增加趨勢，兩者之間存在著較強的正相關（圖3）。

圖3 SD大鼠死后96 h內心血樣本DNA濃度變化趨勢圖

2.3 SD大鼠心血DNA樣本qPCR

對PMI為0～48 h的5個時間點SD大鼠心血樣本進行檢測。根據標準曲線定量結果，幾乎均無擴增，類似陰性，初步得出，PMI為0～48 h，擴增 Ct值均在35以后，說明SD大鼠心血中未有LacZ基因的存在（圖4）。

圖4 PMI為0～48h SD大鼠心血樣本LacZ基因檢測圖譜

對PMI為60～96 h的4個時間點SD大鼠心血樣本進行檢測，同批次擴增標準品，制備標準曲線，根據標準曲線定量結果，發現各時間點的樣本均有擴增產物出現（圖 5～6）。

圖5 標準品質粒擴增圖譜

圖6 PMI為60～96h SD大鼠心血樣本LacZ基因檢測圖譜

以標準品濃度梯度稀釋的對數值為橫坐標，以Ct值為縱坐標建立LacZ熒光定量PCR檢測的標準曲線（圖7）。曲線回歸得標準曲線方程為：Ct=-3.65lgX+27.04（直線斜率 A=-3.65，截距 B=27.04，X 為模板濃度，單位 pg/μL），曲線相關系數r=0.9822，說明標準曲線線性較好。根據A=-1/log（1+E）（E為熒光定量PCR反應的擴增效率），得該次熒光定量PCR擴增效率為88%，符合熒光定量PCR對擴增效率的要求。根據標準曲線，可計算出實際樣本中LacZ基因的濃度，圖中標“×”為實際樣本擴增在標準曲線線性擬合圖中的位置。

圖7 標準曲線線性擬合圖（標×位置為實際樣本）

按照上述標準曲線，對60～96 h的4個時間點心血樣本檢測，每組樣本基因濃度取平均值（表5）。

表5 SD大鼠死后60～96 h心血樣本中LacZ基因濃度

對上述定量檢測樣本中LacZ基因的趨勢圖（圖8）檢測結果顯示在SD大鼠死后60 h LacZ基因濃度開始增加，隨著PMI的延長呈指數式增長，至死后96 h達到高峰。對SD大鼠死后60～96 h心血DNA樣品檢測LacZ基因濃度變化值經EXCEL軟件相關分析，得出回歸方程式：y=3E-06e0.1567x，PMI與DNA濃度的決定系數R2=為0.9569，表明DNA濃度隨著PMI的延長而呈增加趨勢，兩者之間存在著較強的正相關。

圖8 SD大鼠死后60～96 h心血DNA樣本中LacZ基因濃度變化趨勢圖

3 討論

個體死亡后，抑制微生物生長的平衡被打破，腐敗菌開始大量繁殖，并在尸體腐敗的進程中起主導作用。2009年劉茜[4]利用生物發光法檢測大鼠死后不同時間點尸體組織中微生物ATP含量，初步證實在大鼠尸體上腐敗菌存在著量的變化性規律。但是ATP檢測只能反映存活狀態細菌的數量，不能反應出死亡細菌的數量，而且其在死后早期易受個體本身ATP的干擾。2014年謝丹[5]通過檢測尸體不同部位的腐敗菌多樣性的演替規律，發現利用優勢菌群的演替變化可用于推斷PMI，但是該研究只是對優勢菌群的種屬做了定性鑒別，而沒有相關的定量研究，因此推斷的PMI只能是大概的一個時間段，精確性不高且需檢測的指標偏多。

筆者認為，在尸體腐敗降解過程中，無疑存在著腐敗菌數量的變化，通過檢測腐敗菌DNA含量更能準確反映出腐敗菌的變化情況，而目前國內外學者應用qPCR技術定量檢測大腸桿菌的研究主要集中在疾病診斷治療和食品衛生安全等方面[6-8]，本研究將檢測大腸桿菌DNA含量的技術應用到法醫學PMI推斷中來，在國內外研究中罕見報道。

本研究成功的用紫外分光光度計分別檢測了SD大鼠死后0～96 h的心血DNA樣本濃度，結果顯示隨著PMI的延長，樣本DNA濃度呈現線性增長的趨勢，與PMI呈顯著正相關，這可能與個體死后水分流失有關，心血管內血液中的水分等細小分子受重力的影響向外向下滲透，致使血液發生濃縮，血樣本的DNA濃度隨著升高，因此個體死后在一定的時間范圍內檢測心血總DNA濃度可用于推斷PMI。

細菌的生長繁殖分為4個時期：遲緩期（又叫調整期）、對數期（又稱指數期）、穩定期和衰亡期。本研究在SD大鼠死后0～48 h的心血DNA中，均未檢測到LacZ基因的擴增，可能的結果有兩個：（1）心血中沒有大腸桿菌繁殖，自然不會出現LacZ基因擴增；（2）心血中有大腸桿菌，只是處于遲緩期，基因濃度很低，本研究RT-PCR的基因濃度檢測限是≥0.003747pg/μL，而 NTC 的濃度是 0.02pg/μL，可能的原因是擴增試劑本身（如Taq酶來源于大腸桿菌，而目前的提取技術不可能達到完全純化[9]）存在少量大腸桿菌基因組的污染而帶來假陽性的結果，為此本研究人為將基因含量檢測限提高到是≥0.03747 pg/μL，使所測Ct值與NTC沒有重疊，不過這樣也可能造成了一定幾率的假陰性結果產生，導致遲緩期基因擴增結果不明顯。

本研究成功建立了檢測大腸桿菌LacZ基因含量的qPCR方法，結果顯示SD大鼠死后60～96 h心血中大腸桿菌DNA含量與PMI呈顯著正相關，LacZ基因濃度呈指數式增長，這與細菌的二分裂繁殖方式有關，符合細菌的生長曲線規律中對數期（又稱指數期）的特征。值得一提的是，本實驗測定大腸桿菌LacZ基因含量是不區分細菌死活狀態的，無論死亡細菌或存活細菌均能檢測到LacZ基因，這點不同于一般的根據存活細菌數量繪制的細菌生長曲線規律，因此死后96 h以后能否出現細菌生長的穩定期和衰亡期特征還值得進一步的研究。由于本實驗對象SD大鼠的心血存量受限，超過96h的心血難以提取到，故筆者認為為了更好地驗證本研究的實際應用價值，有必要進一步研究不同死亡時間點上的人類尸體與SD大鼠尸體的異同點，并根據預實驗心血存量結果，適當延長樣本檢測PMI時間點，以更大地發揮大腸桿菌LacZ基因含量推斷PMI的作用。

[2]BERG R D.Bacterial Translocation from the Gastrointestinal Tract[J].Trends in Microbiology， 1995， 3（4）:11-30.

[3]O’BOYLE C J.Microbiology of BacterialTranslocation in Humans[J].Gut， 1998， 42（1）:29-35.

[4]劉茜.腐敗微生物及腐敗產物檢測推斷死亡時間的研究[D].湖北：華中科技大學，2009.

[5]謝丹.SSOs演替用于PMI推斷的法醫學研究[D].湖南：中南大學，2014.

[6]ONO S，TSUJIMOTO H，YAMAUCHIA，et al.Detection of Microbial DNA in the Blood of Surgical Patients for Diagnosing Bacterial Translocation[J].World Journal of Surgery，2005，29（4）:535-539.

[7]李云玖，馬恩陵，廉東波，等.實時定量PCR檢測外科發熱患者靜脈血中大腸桿菌DNA的方法[J].中國臨床營養雜志， 2006， 14（2）:70-76.

[8]周微，張偉欽，付宇，等.熒光定量PCR方法快速檢測原料乳中的大腸桿菌[J].中國乳品工業，2009，37（11）:39-42.

[9]HARRISK A，HARTLEY JC.Developmentof Broad-range 16S rDNA PCR for use in the Routine Diagnostic Clinical Microbiology Service[J].Journal of Medical Microbiology，2003，52（8）：685-691.