納米β-硅酸鈣/硒的制備及其抗菌性能

劉玉昆，紀(jì)祥娟，梅 琳，崔 冉，周興平，倪似愚

(1.東華大學(xué) a.生態(tài)紡織教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室; b.化學(xué)化工與生物工程學(xué)院，上海 201620; 2. 魯南煤化工研究院，山東 濟(jì)寧 272000)

近年來(lái)對(duì)于生物材料的研究表明，具備良好生物相容性和抗菌性能的多功能生物活性材料能更好地滿足人體復(fù)雜生理環(huán)境的要求，研究開(kāi)發(fā)具備抗菌性能的多功效生物活性材料具有現(xiàn)實(shí)意義和應(yīng)用價(jià)值。β-硅酸鈣(β-CaSiO3)是一種具有優(yōu)良生物活性、較好生物相容性和良好生物礦化能力的生物陶瓷材料[1-3]。β-CaSiO3在骨修復(fù)和再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域展現(xiàn)出廣闊的應(yīng)用前景并得到持續(xù)研究。其力學(xué)性能優(yōu)于生物玻璃和羥基磷灰石[4-5]，而與磷酸鈣[6-7]生物材料相比，β-CaSiO3因能夠釋放Si2+而具有骨誘導(dǎo)能力[8]。然而，β-CaSiO3本身的抗菌性能并不理想，可通過(guò)引入抗菌活性物質(zhì)賦予其更加優(yōu)良的抗菌活性[9]。

元素硒(Se)是人體的必需微量元素。零價(jià)態(tài)的紅色納米Se因其活性高、細(xì)胞毒性低[10]的特點(diǎn)而得到生物材料領(lǐng)域科研人員的密切關(guān)注[11]。近期研究表明，紅色納米Se具有良好的抗菌性能。Wang等[12]以谷胱甘肽為還原劑、亞硒酸鈉為硒源在紙巾上制得納米Se。抗菌試驗(yàn)表明，納米Se對(duì)金黃色葡萄球菌(S.aureus)具有顯著的抗菌作用。近期，Huang等[13]通過(guò)硼氫化鈉還原亞硒酸鈉制得納米硒顆粒(Se-NPs)并測(cè)試其抗菌性能，結(jié)果表明Se-NPs對(duì)大腸桿菌(E.coli)和金黃色葡萄球菌(S.aureus)均表現(xiàn)出高效抗菌性能。

1 試驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

試劑：油酸鈣，硅酸鈉，環(huán)己烷，亞硒酸鈉，抗壞血酸，磷酸氫二鉀，十二水合磷酸二氫鈉，吐溫-80，LB Broth，LB Broth Agar，無(wú)水乙醇。試驗(yàn)中所用去離子水為自制。

儀器：恒溫磁力攪拌器(S21-1型)，高速離心機(jī)(Centrifuge 5810型)，馬弗爐(KDFS70型)，全自動(dòng)高壓蒸汽滅菌鍋(YXQ-LS-S型)，雙人超凈工作臺(tái)(SW-CJ-2FD型)，全溫控制搖瓶柜(HYG-B型)，隔水式恒溫培養(yǎng)箱(9080型)，X射線光電子能譜儀(AxisUltra DLD型)，X射線粉晶衍射光譜儀(D/max-2550PC型)，透射電子顯微鏡(HITACHI H-800型)。

1.2 納米β-CaSiO3/Se的制備

(1) 稱取3.015 g油酸鈣加入盛有20 mL環(huán)己烷的三口燒瓶中，水浴加熱至40 ℃，不斷攪拌至油酸鈣完全溶解后加入無(wú)水乙醇，攪拌10 min。

(2) 將1.421 g硅酸鈉與20 mL去離子水的混合溶液加入上述三口燒瓶中，75 ℃水浴加熱，回流反應(yīng)2 h。

(3) 待上述反應(yīng)完全并降至室溫后，將0.5 g亞硒酸鈉溶與10 mL去離子水的溶液加入三口燒瓶中，磁力攪拌10 min。隨后滴加1 g抗壞血酸及10 mL 去離子水的混合溶液，溶液逐漸變?yōu)榇u紅色，室溫下反應(yīng)2 h。

(4) 反應(yīng)完成后，分別用去離子水以及無(wú)水乙醇高速離心清洗，制得產(chǎn)物。隨后以2 ℃/min的上升速率，分別在460 ℃以及800 ℃的馬弗爐中煅燒2 h。

1.3 體外抗菌性能測(cè)試

試驗(yàn)菌種：大腸桿菌(ATCC 8099)，金黃色葡萄球菌(ATCC 6538)。

(1) 菌懸液的制備。用接種環(huán)挑取菌種的單菌落于錐形瓶的滅菌液體培養(yǎng)基中，置于37 ℃、160 r/min 的搖床上振蕩培養(yǎng)18 h，制得菌懸液。按照10倍梯度稀釋法將上述菌懸液稀釋100倍。

(2) 試樣的制備。對(duì)照組為空白對(duì)照，直接加入95 mL的滅菌磷酸鹽緩沖溶液(PBS)，混合均勻后，再加入5 mL菌懸液，試驗(yàn)組為分別稱取樣品納米β-CaSiO3、納米β-CaSiO3/Se復(fù)合物0.5 g粉末放入三角燒瓶中，加入95 mL 的PBS，混合均勻后滅菌，再加入5 mL菌懸液。

(3) 振蕩接觸培養(yǎng)。將含對(duì)照樣品和試驗(yàn)樣品的三角燒瓶固定于恒溫振蕩培養(yǎng)箱的搖床上，37 ℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)，檢查樣品稀釋后，振蕩1～4 h。

(4) 振蕩接觸一定時(shí)間后活菌計(jì)數(shù)。振蕩后的對(duì)照樣品和試驗(yàn)樣品經(jīng)適當(dāng)稀釋后，分別取1 mL的樣液接種于無(wú)菌的平面皿中，每個(gè)樣液平行接種3個(gè)平皿，傾注45～55 ℃已融化滅菌的瓊脂營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基，凝固后置于37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中，24h后做菌落計(jì)數(shù)，平皿內(nèi)菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)，即可求出試樣培養(yǎng)皿內(nèi)活菌數(shù)的平均值。試樣的抑菌率計(jì)算如式(1)所示。

(1)

式中：Rab為抑菌率(%)；Ct為對(duì)照樣品與細(xì)菌接觸后表面黏附的平均活菌數(shù)(CFU);Tt為試驗(yàn)樣品與細(xì)菌接觸后表面黏附的平均活菌數(shù)(CFU)。

(5) 試驗(yàn)有效性判斷。若對(duì)照樣品與細(xì)菌接觸24 h后，試樣表面的活菌數(shù)在106CFU/mL以上，試驗(yàn)有效，否則視為無(wú)效重做全部試驗(yàn)。有效試驗(yàn)重復(fù)3次，每次試驗(yàn)每組樣品5個(gè)試樣，求平均值。

(6) 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。所有生物學(xué)試驗(yàn)數(shù)據(jù)均以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)的形式表示，采用單因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，p<0.01視為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與討論

2.1 納米β-CaSiO3/Se的EDS分析

為確定所制備樣品的組分對(duì)其進(jìn)行EDS測(cè)試，納米β-CaSiO3/Se復(fù)合物的EDS圖譜如圖1所示。從圖1可以看出，該樣品主要含有Ca、Si、Se、O等元素，并且這4個(gè)元素的特征峰值較強(qiáng)，表明元素Se被成功引入納米β-CaSiO3中。納米β-CaSiO3/Se中各元素的原子百分比如表1所示。由表1可知，樣品中Se的原子百分相比較理論值偏低，原因是單質(zhì)Se熔點(diǎn)為217 ℃，在460 ℃煅燒過(guò)程中會(huì)有部分損失。

圖1 納米β-CaSiO3/Se復(fù)合物的EDS圖譜Fig.1 EDS spectra of nano-β-CaSiO3/Se

表1 納米β-CaSiO3/Se復(fù)合物中的主要元素組成Table 1 Elemental compositions of nano-β-CaSiO3/Se

2.2 納米β-CaSiO3/Se的XRD分析

對(duì)試樣進(jìn)行XRD測(cè)試，進(jìn)一步分析納米β-CaSiO3/Se復(fù)合物中各組分晶型。不同煅燒溫度下納米β-CaSiO3/Se復(fù)合物XRD圖譜如圖2所示。圖譜a為經(jīng)過(guò)460 ℃煅燒后的樣品，其衍射數(shù)據(jù)與JCPDS標(biāo)準(zhǔn)卡片No.73-0465的六方晶相硒的數(shù)據(jù)相符，表明經(jīng)過(guò)460 ℃煅燒后的樣品含有六方晶系的Se; 同JCPDS標(biāo)準(zhǔn)卡片No.84-0654的β-CaSiO3數(shù)據(jù)相符，可知樣品中硅酸鈣晶型為β-CaSiO3。經(jīng)過(guò)800 ℃煅燒的樣品XRD衍射圖譜對(duì)比標(biāo)準(zhǔn)卡片同樣表現(xiàn)出β-CaSiO3的特征峰，然而沒(méi)有出現(xiàn)單質(zhì)Se的特征峰。這主要是因?yàn)閱钨|(zhì)Se的熔點(diǎn)是217 ℃，所以經(jīng)過(guò)800 ℃高溫煅燒后，樣品內(nèi)不含有單質(zhì)Se。

圖2 不同煅燒溫度下的納米β-CaSiO3/Se復(fù)合物XRD圖譜Fig.2 XRD spectra of nano-β-CaSiO3/Se with different sintering temperature

2.3 納米β-CaSiO3/Se的TEM分析

使用TEM觀察納米β-CaSiO3/Se的復(fù)合物(460 ℃煅燒)的微觀形貌，結(jié)果如圖3所示。由圖3可以直觀地看到，該納米β-CaSiO3/Se樣品在溶液中的分散性較好，樣品的顆粒直徑較為均勻，顆粒直徑分布范圍為112～341 nm。

圖3 納米β-CaSiO3/Se復(fù)合物(460 ℃煅燒)的TEM圖Fig.3 TEM images of nano-β-CaSiO3/Se with sintering temperature of 460 ℃

2.4 納米β-CaSiO3/Se的體外抗菌性能測(cè)試

為準(zhǔn)確測(cè)定納米β-CaSiO3/Se的抗菌性能，對(duì)納米β-CaSiO3和納米β-CaSiO3/Se的抗菌性能分別做出定性以及定量的分析。樣品對(duì)E.coli和S.aureus的抗菌性能定性分析試驗(yàn)效果圖如圖4所示。由圖4可知，與對(duì)照組相比，E.coli和S.aureus與納米β-CaSiO3接觸培養(yǎng)24h后菌落數(shù)量出現(xiàn)一定程度下降，納米β-CaSiO3/Se組的E.coli和S.aureus數(shù)量明顯減少。對(duì)樣品抗菌性能定量分析的抑菌率結(jié)果統(tǒng)計(jì)圖如圖5所示。從圖5可得出，納米β-CaSiO3對(duì)E.coli和S.aureus的抑菌率分別為(38±3)%和(42±3)%，納米β-CaSiO3/Se復(fù)合物對(duì)E.coli和S.aureus的抑菌率分別達(dá)到(92±4)%和(95±4)%。

上述試驗(yàn)結(jié)果表明，納米β-CaSiO3抗菌性能極為有限，Se的加入可以顯著提高β-CaSiO3的抗菌性能。

(a) E.coli空白對(duì)照

(b) E.coli β-CaSiO3

(c) E.coli β-CaSiO3/Se

(d) S.aureus空白對(duì)照

(e) S.aureus β-CaSiO3

(f) S.aureus β-CaSiO3/Se

圖4E.coli和S.aureus與試樣接觸培養(yǎng)24h后的菌落數(shù)照片

Fig.4ThecolonynumberofE.coliandS.aureuscontactedwithspecimensafter24h

圖5 E.coli和S.aureus與試樣接觸培養(yǎng)24 h后的抑菌率統(tǒng)計(jì)(*表示樣品試驗(yàn)組與空白組之間有差異)(Mean±SD，n=5，** p<0.01)Fig.5 E. coli and S. aureus antibacterial activity of nano-β-CaSiO3 and nano-β-CaSiO3/Se (* indicates the difference between specimens and blank) (Mean±SD，n=5，** p<0.01)

3 結(jié) 語(yǔ)

本文在采用油水界面法合成納米β-CaSiO3的基礎(chǔ)上，運(yùn)用氧化還原法將紅色納米Se引入納米β-CaSiO3， 制備得到納米β-CaSiO3/Se復(fù)合物。通過(guò)EDS分析表明，該復(fù)合物中主要元素為Ca、Si、O、Se，樣品中Ca、Si、Se所占原子比為17.27∶17.13∶12.11。XRD分析證明納米β-CaSiO3晶型以及六方晶型納米Se的存在。通過(guò)TEM觀察表明，納米β-CaSiO3/Se樣品在溶液中的分散性較好，樣品的直徑范圍為112～341 nm。

納米β-CaSiO3、納米β-CaSiO3/Se復(fù)合物對(duì)E.coli和S.aureus的抗菌試驗(yàn)表明：納米β-CaSiO3有一定的抗菌性，對(duì)E.coli和S.aureus的抑菌率分別為(38±3)%和(48±3)%；納米β-CaSiO3/Se復(fù)合物具有優(yōu)良的抗菌性能，對(duì)E.coli和S.aureus抑菌率分別為(92±4)%和(95±4)%。由此可知納米Se的加入使得納米β-CaSiO3的抗菌性能顯著增強(qiáng)。

參 考 文 獻(xiàn)

[1] EL-NAHRAWY A M，ALI A I，ABOU HAMMAD A B，et al. Influences of Ag-NPs doping chitosan/calcium silicate nanocomposites for optical and antibacterial activity [J]. Int J Biol Macromol，2016，93: 267-275.

[2] ARCOS D，BOCCNCCINI A R，BOHNER M，et al. The relevance of biomaterials to the prevention and treatment of osteoporosis [J]. Acta Biomaterialia，2014，10(5): 1793-1805.

[3] WU C T，CHANG J. Silicate bioceramics for bone tissue regeneration [J]. Journal of Inorganic Materials，2013，28(1): 29-39.

[4] GONG T，WANG Z，ZHANG Y，et al. Preparation，characterization，release kinetics，and in vitro cytotoxicity of calcium silicate cement as a risedronate delivery system [J]. Journal of Biomedical Materials Research Part A，2014，102(7): 2295-2304.

[5] SADAT-SHOJAI M，KHORASANI M T，DINPANAH-KHOSHDARGI E，et al. Synthesis methods for nanosized hydroxyapatite with diverse structures [J]. Acta Biomaterialia，2013，9(8): 7591-7621.

[6] SAMAVEDI S，WHITTINGTON A R，GOLDSTEIN A S. Calcium phosphate ceramics in bone tissue engineering: A review of properties and their influence on cell behavior [J]. Acta Biomaterialia，2013，9(9): 8037-8045.

[7] COMBES C，REY C. Amorphous calcium phosphates: Synthesis，properties and uses in Biomaterials [J]. Acta Biomaterialia，2010，6(9): 3362-3378.

[8] SHIRAZI F S，MOGHADDAM E，MEHRALI M，et al. In vitro characterization and mechanical properties of beta-calcium silicate/POC composite as a bone fixation device [J]. Journal of Biomedical Materials Research Part A，2014，102(11): 3973-3985.

[9] RODRíGUEZ-VALENCIA C，LóPEZ-áLVAREZ M，COCHóN-CORES B，et al. Novel selenium-doped hydroxyapatite coatings for biomedical applications [J]. Journal of Biomedical Materials Research Part A，2013，101(3): 853-861.

[10] 吳永軍，倪永紅. 海藻酸鈉法低溫水浴制備納米硒與表征 [J]. 食品工業(yè)科技，2012，8(33): 295-298.

[11] WANG Q，WEBSTER T J. Short communication: inhibiting biofilm formation on paper towels through the use of selenium nanoparticles coatings [J]. International Journal of Nanomedicine，2013，8(1): 407-411.

[12] WANG Q，WEBSTER T J. Short communication: Inhibiting biofilm formation on paper towels through the use of selenium nanoparticles coatings [J]. International Journal of Nanomedicine，2013(8): 407-411.

[13] HUANG X，CHEN X，CHEN Q，et al. Investigation of functional selenium nanoparticles as potent antimicrobial agents against superbugs [J]. Acta Biomaterialia，2015，30: 397-407.

[14] SHI T T，CAI Y T，LIU L，et al. Formation process of m-ZrO2nanoparticles by the oil/water interface method combined with seeding technique [J].Colloids and Surfaces A，2015，469: 83-92.

[15] HUANG X Y，LIU Y G，ZHOU X P，et al. Formation of oil-soluble uniform anatase titania nanoparticles and their characterization [J].Colloids and Surfaces A，2013，423: 115-123．

[16] DENG N T，ZHOU X P，LI X，et al. Synthesis of NaYF4: Yb，Er/NaYF4nanoparticles coated with PAM by in-situ polymerization[J]. Journal of Physics and Chemistry of Solids，2013，74(3): 480-489.