日本山椒的復(fù)葉離體培養(yǎng)與植株高頻再生

秦素潔 ，趙玉芬 ，魏安智 3，李國(guó)松 4，趙京獻(xiàn) ，郭偉珍

（1.河北省林業(yè)科學(xué)研究院，河北 石家莊 050061；2.河北省林木良種工程技術(shù)中心，河北 石家莊050061；3.西北農(nóng)林科技大學(xué)，陜西 楊凌 712100；4.河北省林木種苗管理站，河北 石家莊 050081）

日本山椒Zanthoxylum piperitumDe Candolle為蕓香科花椒屬落葉小灌木，株高3 m 左右，雌雄異株，有些變異品種無(wú)刺或少刺。其果皮、青果、種子、枝干、嫩芽等均有重要的應(yīng)用價(jià)值。日本山椒喜溫暖、濕潤(rùn)的氣候條件，其耐寒性、耐熱性中等，抗病能力強(qiáng)，尤其具有較強(qiáng)的抗流膠病能力[1-2]。與國(guó)內(nèi)的花椒品種相比，日本山椒優(yōu)良品種具有豐產(chǎn)與穩(wěn)產(chǎn)性好、抗逆性強(qiáng)和風(fēng)味獨(dú)特、無(wú)皮刺、食用及藥用價(jià)值高等優(yōu)點(diǎn)[2]。河北省林業(yè)科學(xué)研究院自2000年以來(lái)陸續(xù)引進(jìn)日本山椒品種7個(gè)，經(jīng)過(guò)多年的引種試驗(yàn)，確定了石家莊以南地區(qū)為日本山椒的適宜栽培區(qū)，山東半島及長(zhǎng)江流域?yàn)槠渥罴言耘鄥^(qū)域[1]。

花椒生產(chǎn)上以實(shí)生繁殖為主，導(dǎo)致了品種退化、產(chǎn)量降低、株間整齊度差等問(wèn)題的出現(xiàn)。利用組織培養(yǎng)可以快速高效地育苗，從而為生產(chǎn)提供大量的優(yōu)質(zhì)苗木。由于受引種的限制，日本花椒目前多采用組織培養(yǎng)、嫁接繁殖等方法[3]進(jìn)行繁殖；郭偉珍曾對(duì)日本朝倉(cāng)花椒進(jìn)行了硬枝扦插育苗試驗(yàn)[4]。有關(guān)花椒組織培養(yǎng)和再生的研究主要集中在利用花椒帶芽莖段進(jìn)行快速繁殖上[3-11]，也有以花椒葉片、葉柄實(shí)現(xiàn)再生的研究報(bào)道[5,12-14]。但是，目前相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道的花椒葉片、葉柄離體培養(yǎng)均先通過(guò)誘導(dǎo)愈傷組織再進(jìn)行芽的分化，且存在芽的誘導(dǎo)率低、產(chǎn)生芽的誘導(dǎo)時(shí)間長(zhǎng)等問(wèn)題。而對(duì)山椒的整個(gè)復(fù)葉離體高頻誘導(dǎo)不定芽直接再生的研究卻未見(jiàn)報(bào)道。為此，本文探討了一種簡(jiǎn)便、高效的山椒復(fù)葉離體再生的方法和途徑，以期為山椒的組培快繁和遺傳育種提供技術(shù)支持，同時(shí)為其他樹(shù)種尤其是復(fù)葉樹(shù)種的離體高頻再生提供參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材 料

供試外植體為‘琉錦山椒’Zanthoxylum piperitum‘Riyujin-Sansho’和‘花山椒’Zanthoxylum piperitum.Var.froma inerme試管苗的復(fù)葉。

圖1 復(fù)葉外植體接種狀態(tài)Fig.1 Compound leaf explants inoculation

1.2 方 法

1.2.1 葉片離體培養(yǎng)

取繼代培養(yǎng)30 d的試管苗中、上部1～3個(gè)幼嫩復(fù)葉，垂直葉軸橫切2刀刻傷，葉背面朝下，將整個(gè)復(fù)葉平鋪接種在不定芽再生培養(yǎng)基上（如圖1所示）。每處理10瓶，每瓶接種1個(gè)復(fù)葉，重復(fù)3次。不定芽再生誘導(dǎo)培養(yǎng)基設(shè)用如下幾種組合培養(yǎng)基：處理Ⅰ為MS＋6-BA 1.0 mg·L-1＋I(xiàn)BA 0.2 mg·L-1；處理Ⅱ?yàn)?MS ＋ 6-BA 1.5 mg·L-1＋I(xiàn)BA 0.2 mg·L-1；處理Ⅲ為 MS ＋ 6-BA 2.0 mg·L-1＋I(xiàn)BA 0.2 mg·L-1；處理Ⅳ為 MS ＋ 6-BA 3.0 mg·L-1＋I(xiàn)BA 0.2 mg·L-1。附加瓊脂 6 g·L-1，白砂糖 30 g·L-1，培養(yǎng)基的pH值為5.8。培養(yǎng)室溫度設(shè)為（25±2）℃，暗培養(yǎng)10 d后轉(zhuǎn)入光照培養(yǎng)，光照強(qiáng)度為2 000 lx，光照時(shí)間為16 h·d-1，在此條件下培養(yǎng)20 d，共培養(yǎng)30 d后調(diào)查芽的再生芽數(shù)量、再生率及生長(zhǎng)情況。

采用SPSS數(shù)據(jù)處理軟件進(jìn)行方差分析，采用Duncan新復(fù)極差法進(jìn)行多重比較。

1.2.2 復(fù)葉葉軸刻傷

試驗(yàn)中對(duì)整個(gè)葉軸進(jìn)行橫切刻傷處理，將同一復(fù)葉葉軸上刻傷的程度分為深度（葉軸的2/3）和淺度（葉軸的1/3）兩種，以不刻傷為對(duì)照。每處理10瓶，每瓶接種1個(gè)復(fù)葉，重復(fù)3次，將‘琉錦山椒’接種在Ⅱ號(hào)培養(yǎng)基上，將‘花山椒’接種在Ⅰ號(hào)培養(yǎng)基上，其他培養(yǎng)條件同上。培養(yǎng)30 d后調(diào)查芽的再生數(shù)量和再生率。

1.2.3 繼代培養(yǎng)與生根培養(yǎng)

繼代培養(yǎng)基設(shè)用MS＋6-BA0.5 mg·L-1＋I(xiàn)BA0.2 mg·L-1（即處理Ⅴ）。將復(fù)葉離體誘導(dǎo)的不定芽芽叢接種于Ⅴ號(hào)培養(yǎng)基上進(jìn)行繼代培養(yǎng)，每隔25～30 d繼代培養(yǎng)1次。

生根培養(yǎng)基設(shè)用1/4 MS＋I(xiàn)BA 0.2 mg·L-1＋NAA 0.3 mg·L-1＋2.5%蔗糖＋0.6%瓊脂（即處理Ⅵ）。當(dāng)苗高為2.5～3.0 cm時(shí)，將其接種在Ⅵ號(hào)培養(yǎng)基上進(jìn)行生根培養(yǎng)，每品種接種5瓶，每瓶10株，重復(fù)2次。培養(yǎng)的光照時(shí)間為10～12 h·d-1。共培養(yǎng)30 d后調(diào)查2個(gè)品種的生根率、生根條數(shù)及根長(zhǎng)度。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同品種對(duì)日本山椒試管苗離體復(fù)葉不定芽再生能力的影響

不同濃度的6-BA與IBA組合培養(yǎng)基處理對(duì)日本山椒離體復(fù)葉不定芽再生的影響情況如表1。由表1可知，不同品種試管苗離體復(fù)葉的不定芽再生能力有所不同。在供試的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ號(hào)培養(yǎng)基上，‘琉錦山椒’誘導(dǎo)芽的再生率分別為83.33%、90%、66.77%、66.77%，每復(fù)葉再生芽的數(shù)量分別達(dá)到了4.17、5.42、5.80、3.61 個(gè)；而‘花山椒’誘導(dǎo)芽的再生率分別為80%、76.67%、66.33%、60.33%，每復(fù)葉再生芽的數(shù)量分別達(dá)到了4.16、3.47、2.90、2.26 個(gè)。‘琉錦山椒’的芽再生率和再生芽數(shù)量均高于‘花山椒’，這與品種的基因型有著明顯的關(guān)系。

表1 不同濃度的6-BA與IBA培養(yǎng)基處理對(duì)日本山椒離體復(fù)葉不定芽再生的影響?Table 1 Effect of different concentrations of 6-BA with IBA on the organ regeneration from in vitro cultured leaves of Z.piperitum DC.

2.2 不同濃度的6-BA與IBA組合培養(yǎng)基處理對(duì)日本山椒離體復(fù)葉不定芽再生能力的影響

不同濃度的6-BA和IBA組合培養(yǎng)基處理對(duì)日本山椒離體復(fù)葉的不定芽再生能力有著顯著的影響。當(dāng)IBA的濃度為0.2 mg·L-1時(shí)，隨著6-BA濃度的增加，‘琉錦山椒’不定芽的再生率和再生芽數(shù)量均呈先升高后下降的變化趨勢(shì)。當(dāng)6-BA濃度為1.0 mg·L-1時(shí)，‘琉錦山椒’的不定芽再生率為83.33%，每復(fù)葉再生芽的數(shù)量為4.17 個(gè)；當(dāng)6-BA濃度達(dá)到1.5 mg·L-1時(shí)，芽再生率最高達(dá)到了90%，每復(fù)葉再生芽的數(shù)量達(dá)到5.42 個(gè)，芽再生率和再生芽數(shù)量均達(dá)了顯著性差異；當(dāng)6-BA濃度增加到2.0 mg·L-1時(shí)，芽再生率迅速下降，而再生芽的數(shù)量達(dá)到最高值，與濃度為1.5 mg·L-1的6-BA處理的再生率間存在顯著性差異，但其再生芽數(shù)量間卻無(wú)顯著性差異；當(dāng)6-BA濃度增加到3.0 mg·L-1時(shí)，芽再生率不再下降，但再生芽的數(shù)量卻明顯減少，和前3種濃度處理間存在5%的顯著性差異。隨著6-BA濃度的增加，誘導(dǎo)出的芽體逐漸變小。這一結(jié)果說(shuō)明，6-BA濃度的過(guò)低或過(guò)高都會(huì)抑制日本山椒復(fù)葉的芽再生率和再生芽的數(shù)量，只有適宜的濃度才能達(dá)到高頻再生。方差分析結(jié)果表明，‘琉錦山椒’的最適誘導(dǎo)培養(yǎng)基為Ⅱ號(hào)組合培養(yǎng)基，即MS＋6-BA1.5 mg·L-1＋I(xiàn)BA0.2 mg·L-1。

隨著6-BA濃度的增加，‘花山椒’的再生芽率、再生芽數(shù)量、誘導(dǎo)的芽體大小均呈遞減趨勢(shì)。當(dāng)6-BA濃度為1.0 mg·L-1時(shí)，其再生芽率與濃度為1.5 mg·L-1的6-BA處理間沒(méi)有顯著性差異，而與濃度分別為2.0、3.0 mg·L-1的6-BA處理間在5%水平上均有顯著性差異；其再生芽的數(shù)量高于其他3個(gè)處理，并達(dá)到了1%的極顯著性差異水平。分析結(jié)果表明，‘花山椒’的最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基為Ⅰ號(hào)培養(yǎng)基，即為MS＋6-BA 1.0 mg·L-1＋I(xiàn)BA 0.2 mg·L-1。

2.3 刻傷處理對(duì)日本山椒離體復(fù)葉不定芽再生能力的影響

將接種的2個(gè)品種復(fù)葉暗培養(yǎng)10 d轉(zhuǎn)為光培養(yǎng)5 d后，小葉片開(kāi)始增厚變綠，部分小葉片翹離培養(yǎng)基面，接種20 d后，均開(kāi)始有再生芽萌發(fā)，但2個(gè)品種的表現(xiàn)不同。‘琉錦山椒’深度切傷的斷面有少量綠色愈傷組織形成，但是沒(méi)有產(chǎn)生新的再生芽體；淺度刻傷的傷口自動(dòng)愈合，沒(méi)有愈傷組織形成。‘花山椒’深度切傷的斷面處形成了較多的淡黃色愈傷組織，也沒(méi)有芽體生成。復(fù)葉的小葉葉腋處不具腋芽，僅有總?cè)~柄葉腋處具腋芽[15]。但在植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑調(diào)控和刻傷的刺激下，2個(gè)品種均在小葉葉腋處（小葉和葉軸連接處）直接產(chǎn)生了不定芽及芽叢（如圖2A與B所示）。刻傷處理對(duì)日本山椒離體復(fù)葉不定芽再生的影響情況見(jiàn)表2。表2表明，與不刻傷處理（對(duì)照）相比，刻傷處理對(duì)2個(gè)品種的復(fù)葉離體再生不定芽均有促進(jìn)作用，但部分葉軸有隆起現(xiàn)象（如圖2C所示），仍能正常生長(zhǎng)。

圖2 ‘琉錦山椒’和‘花山椒’的復(fù)葉芽體直接再生情況Fig.2 Regeneration bud of ‘Riyujin-Sansho’ and Var.froma inerme

表2 刻傷處理對(duì)日本山椒離體復(fù)葉不定芽再生的影響Table 2 Effects of carved injury on regeneration of leaves in vitro for Z.piperitum DC.

2.4 繼代培養(yǎng)與生根培養(yǎng)

2.4.1 繼代培養(yǎng)

將復(fù)葉離體誘導(dǎo)的不定芽芽叢接種至繼代增殖培養(yǎng)基（Ⅴ號(hào)培養(yǎng)基，即為MS＋6-BA 0.5 mg·L-1＋I(xiàn)BA 0.2 mg·L-1）上進(jìn)行壯苗增殖培養(yǎng)，培養(yǎng)25～30 d后繼代培養(yǎng)1次，結(jié)果分別如圖3A與B所示。

2.4.2 生根培養(yǎng)

將生長(zhǎng)健壯、苗高在2.5～3.0 cm以上的嫩尖切下接種到Ⅵ號(hào)生根培養(yǎng)基上，在生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)10 d后，莖基部開(kāi)始膨大，培養(yǎng)15 d開(kāi)始有疏松的白色愈傷組織形成，培養(yǎng)20 d有根生成，并迅速伸長(zhǎng)，但是，2個(gè)品種均存在生根不均勻的現(xiàn)象（如圖3 A與B所示）。

圖3 ‘琉錦山椒’和‘花山椒’的壯苗與增殖狀態(tài)Fig.3 Subculture of ‘Riyujin-Sansho’ and Var.froma inerme

日本山椒離體復(fù)葉不定芽的生根表現(xiàn)如表3。由表3可知，培養(yǎng)30 d后，‘琉錦山椒’的生根率、平均生根條數(shù)、平均最長(zhǎng)根長(zhǎng)均略高于‘花山椒’，這可能與品種特性及繼代分化培養(yǎng)過(guò)程中激素的積累有關(guān)。

圖4 ‘琉錦山椒’和‘花山椒’的生根狀態(tài)Fig.4 Roots of ‘Riyujin-Sansho’ and Var.froma inerme

2.5 煉苗與移栽管理

當(dāng)根長(zhǎng)至0.5～1.0 cm時(shí)，將試管苗移至煉苗室，打開(kāi)瓶口煉苗4～5 d。當(dāng)試管苗生長(zhǎng)健壯、葉色轉(zhuǎn)濃綠時(shí)可將其移栽到育苗箱的蛭石中，注意洗凈培養(yǎng)基，用塑料薄膜覆蓋好，溫度控制為18～25 ℃，空氣相對(duì)濕度為85%。幼苗長(zhǎng)出新根后逐步揭開(kāi)薄膜，每隔7 d噴1次殺菌劑和營(yíng)養(yǎng)液，移栽后的溫濕度管理是影響成活率的關(guān)鍵因素。移栽30 d統(tǒng)計(jì)得到，‘琉錦山椒’與‘花山椒’的移栽成活率分別達(dá)到了79.5%和76%，移栽40 d后可移栽上缽。

3 結(jié)論與討論

日本花椒（山椒）雌雄異株，不同品種之間以及雌株與雄株之間的基因型和表現(xiàn)型均有較大差異。本試驗(yàn)以‘琉錦山椒’和‘花山椒’為材料，在培養(yǎng)過(guò)程中芽的誘導(dǎo)率和再生芽數(shù)量及生長(zhǎng)表現(xiàn)也有很大差異，其受基因型的影響較大，相對(duì)于‘琉錦山椒’而言，‘花山椒’所需激素水平要低些。

以往的花椒葉片離體培養(yǎng)研究中報(bào)道，不論是田間幼葉還是試管苗幼葉，大多采用了低細(xì)胞分裂素（6-BA 0.3 ～ 0.5 mg·L-1或 TDZ 0.03 mg·L-1）與低濃度生長(zhǎng)素（2,4-D 0.2～0.5 mg·L-1、NAA 0.05～0.20 mg·L-1）配比的培養(yǎng)基。姜長(zhǎng)陽(yáng)等人[12]報(bào)道了以花椒幼葉為外植體，以MS＋BA 0.5 mg·L-1＋2-4D 0.2 mg·L-1＋ NAA 0.05 mg·L-1和 MS ＋ BA 0.3 mg·L-1＋ NAA 0.1 mg·L-1培養(yǎng) 120 ～ 130 d 后愈傷組織分化芽的誘導(dǎo)率達(dá)到10%。王港等人[13]以‘鳳椒’嫩葉為試材，以MS＋2,4-D 0.5 mg·L-1＋BA 0 .5 mg·L-1為培養(yǎng)基，結(jié)果產(chǎn)生的愈傷組織誘導(dǎo)率達(dá)到90%；在MS＋TDZ 0.03 mg·L-1＋BA 0.1 mg·L-1中培養(yǎng) 60 d后其愈傷組織分化芽的誘導(dǎo)率達(dá)70%。曾曉芳分別以日本‘朝倉(cāng)花椒’試管苗的葉片、葉柄為試材，以WPM＋6-BA 0.5 mg·L-1＋NAA 0.2 mg·L-1為最佳培養(yǎng)基，葉片的愈傷組織分化率最高僅為2.52%，葉柄的誘導(dǎo)分化率最高為60%，且培養(yǎng)60 d才分化出芽，他們因此認(rèn)為，葉片不適合作為外植體進(jìn)行培養(yǎng)[15]。

有些研究者認(rèn)為，細(xì)胞分裂素的濃度對(duì)增值系數(shù)的影響存在極顯著差異[16-19]。王瑞等人認(rèn)為，細(xì)胞分裂素濃度越高，增值系數(shù)則越大[16]；而秦新惠等人認(rèn)為，隨著6-BA質(zhì)量濃度降低，增值系數(shù)越來(lái)越高，降至0.1～0.5 mg·L-1，增值系數(shù)達(dá)到最大[17]；陳容等人、暴甜等人的研究結(jié)果均表明，6-BA濃度過(guò)高或過(guò)低均不利于不定芽的形成和增殖[18-19]，這與本試驗(yàn)結(jié)果“6-BA（細(xì)胞分裂素）濃度過(guò)低或過(guò)高均不利于芽的再生”一致。當(dāng)6-BA 1.0 ～ 1.5 mg·L-1與 IBA 0.2 mg·L-1的配比為5.0～7.5∶1.0時(shí)，培養(yǎng)30 d，‘琉錦山椒’與‘花山椒’的再生芽誘導(dǎo)率分別達(dá)到90%和80%，每復(fù)葉的再生芽數(shù)量分別達(dá)到5.42和4.16 個(gè)，高于王平等人[20]對(duì)蜆殼花椒試管苗葉片的試驗(yàn)結(jié)果（經(jīng)愈傷組織誘導(dǎo)后，在6-BA 0.5 mg·L-1＋NAA 0.1 mg·L-1培養(yǎng)基上，不定芽再生率為61%，再生芽數(shù)量達(dá)到3.2個(gè)）；李曉東等[21]選取胡椒木當(dāng)年生枝條的幼嫩葉片作為外植體，將其接種在MS ＋ 6-BA 1.0 mg·L-1＋ NAA 0.7 mg·L-1，經(jīng)過(guò) 6 周的培養(yǎng)，芽的誘導(dǎo)分化率最高達(dá)到91.7%。本試驗(yàn)結(jié)果與李曉東等人的誘導(dǎo)率相近，但芽的誘導(dǎo)時(shí)間比其縮短了近2周。

前人對(duì)蘋(píng)果試管苗的研究結(jié)果表明，不同切傷方法對(duì)葉片發(fā)生不定芽能力的影響沒(méi)有明顯差異，而切傷與不切傷對(duì)葉片不定芽的發(fā)生能力卻有很大影響，從再生率、每葉發(fā)生的不定芽數(shù)、再生力等方面看，切傷處理的均比不切傷的高，這說(shuō)明切傷是促進(jìn)不定芽發(fā)生的重要刺激因素[22]。柴慈江等人研究了珠美海棠葉片不同的切傷方式，結(jié)果表明，以橫切主脈處理的切口處芽的再生率為最高[23]。本試驗(yàn)在葉軸上刻傷后，對(duì)不定芽的再生有明顯的刺激作用，提高了芽的再生率和再生芽數(shù)量，這與孫清榮在蘋(píng)果葉片上的研究結(jié)論一致[22]。

離體培養(yǎng)過(guò)程中出現(xiàn)了部分小葉和部分葉軸拱起而脫離了培養(yǎng)基表面的現(xiàn)象，但是，再生芽生長(zhǎng)沒(méi)有受到影響，部分葉軸拱起可能是由切傷和葉片的增厚所致，但不影響營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的運(yùn)輸。本試驗(yàn)中還出現(xiàn)了另外一種現(xiàn)象，即葉軸的中后端比前端容易誘導(dǎo)出芽，這可能與復(fù)葉不同部位的組織成熟度有關(guān)。

總之，以‘琉錦山椒’與‘花山椒’試管苗復(fù)葉離體培養(yǎng)，直接誘導(dǎo)不定芽的再生體系，不僅越過(guò)愈傷組織階段，且再生率及再生芽數(shù)量均較高，大大縮短了外植體的出芽時(shí)間。以試管苗復(fù)葉為外植體，取材數(shù)量多、便捷、極大地降低了外植體的污染率，經(jīng)過(guò)直接器官發(fā)生途徑誘導(dǎo)分化的不定芽，轉(zhuǎn)接到壯苗繼代增殖培養(yǎng)基上能正常生長(zhǎng)發(fā)育，且能在生根培養(yǎng)基中生根。山椒復(fù)葉離體誘導(dǎo)不定芽的直接再生是山椒離體高頻再生的新途徑。本文僅對(duì)日本山椒的2個(gè)品種的復(fù)葉進(jìn)行了離體培養(yǎng)和再生試驗(yàn)，而對(duì)其他品種特別是國(guó)內(nèi)花椒品種的相關(guān)研究尚需深入展開(kāi)。

[1]趙京獻(xiàn),畢 君,王春榮,等.日本無(wú)刺花椒新品種引種觀察[J].山西果樹(shù),2006(6):36-37.

[2]徐 惠,吳宗興.日本無(wú)刺花椒考察報(bào)告[J].四川林業(yè)科技,2015,36(6):107-116.

[3]韓素英,齊力旺,楊云龍,等.花椒的離體培養(yǎng)再生植株[J].山西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),1995,15(2):202-204.

[4]郭偉珍,王金菊,林 艷,等.日本朝倉(cāng)花椒硬枝扦插育苗試驗(yàn)[J].河北林業(yè)科技,2006(2):14-15.

[5]吳國(guó)粱,常留印.花椒嫩莖段培養(yǎng)及植株再生[J].植物生理學(xué)通訊,1993,29(2):104.

[6]石小巖,楊繼紅,林木蘭.日本花椒的組織培養(yǎng)[J].植物生理通迅,1995,31(2):120.

[7]曾 慎.山椒的組織培養(yǎng)與快速繁殖[J].植物生理學(xué)通訊,2003,39(4):353.

[8]陳霄鵬,呂瑞娥.日本無(wú)刺花椒的組培快繁技術(shù)[J].林業(yè)實(shí)用技術(shù),2005(9):23-24.

[9]郭偉珍,林 艷,畢 君,等.朝倉(cāng)花椒組織培養(yǎng)快繁試驗(yàn)[J].林業(yè)科技開(kāi)發(fā),2005,19(5):19-21.

[10]王麗艷,荊瑞勇.花椒組織培養(yǎng)與快速繁殖技術(shù)研究[J].華北農(nóng)學(xué)報(bào),2006,21(增刊):67-69.

[11]周 徽.生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)漢源花椒離體培養(yǎng)及植株再生的影響[D].成都:四川農(nóng)業(yè)大學(xué),2014.

[12]姜長(zhǎng)陽(yáng),鄒 霞.花椒的組織培養(yǎng)[J].植物生理學(xué)通訊,1991,27(6): 431.

[13]王 港,李周岐,劉曉敏,等.花椒組織培養(yǎng)再生體系的建立[J].西北林學(xué)院學(xué)報(bào),2008 23(3):117-119.

[14]崔 丹,魏安智,候 娜,等.花椒離體愈傷組織誘導(dǎo)研究[J].西北林學(xué)院學(xué)報(bào),2016,31(5):138-141.

[15]曾曉芳.花椒再生體系的建立及ipt基因遺傳轉(zhuǎn)化研究[D].貴陽(yáng):貴州大學(xué),2008.

[16]王 瑞,陳永忠,王湘南,等.油茶組培苗高效增殖體系的建立[J].中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報(bào),2015,35(10):40-43.

[17]秦新惠,崔興林,吳興寶,等.沙地蛋白桑高效組培快繁體系的建立[J].經(jīng)濟(jì)林研究,2016,34(3):169-174.

[18]陳 容,張黨權(quán),鄭玉娟,等.紅檵木腋芽高效快繁研究[J].經(jīng)濟(jì)林研究,2015,33(4):96-101.

[19]暴 甜,蘇淑釵,高 赫,等.毛梾優(yōu)良無(wú)性系組培體系建立[J].中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報(bào),2017,37(6):70-74.

[20]王 平,王海霞,馬英姿,等,蜆殼花椒葉片不定芽誘導(dǎo)與內(nèi)源激素的變化規(guī)律[J].中草藥,2008,39(9):1400-1403.

[21]李曉東,徐 浩,張曉紅,等.胡椒木葉片離體培養(yǎng)與植株再生[J].西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2009,18(2):213-216.

[22]孫清榮.影響蘋(píng)果葉片不定芽再生的幾個(gè)因素[J].落葉果樹(shù),1995(4):3-4.

[23]柴慈江,孫世海,王 玉,等.珠美海棠葉片離體培養(yǎng)與植株再生[J].果樹(shù)學(xué)報(bào),2011,28(1):124-128.