C57BL/6小鼠尾靜脈四種穿刺方法的比較

溫軍業，范曉燕，何東偉，張萬星，黃書靜，張宇龍(.河北省人民醫院普外三科，石家莊 050000； 2.河北省人民醫院腫瘤科，石家莊 050000； .河北醫科大學第四醫院，石家莊 050000； .石家莊市第一醫院外三科，石家莊 050000)

動物模型中常用到小鼠，特別是C57BL/6小鼠，是腫瘤學、生理學、免疫學、遺傳學等研究中常用的品系。小鼠通過尾靜脈采血、給藥等是免疫學小鼠動物實驗中的常用操作技術，因此尾靜脈穿刺的成功與否直接決定著實驗能否順利進行[1]。不同于白色小鼠，C57BL/6小鼠因其體表為黑色，故常規實驗條件下其尾靜脈觀察存在一定的難度。該品系小鼠尾部共有3根靜脈，分別為背側靜脈、左側和右側外周靜脈。一般選擇左側或右側外周靜脈進行穿刺取血，所以實驗是否能夠達到預期療效，取決于鼠尾靜脈注射給藥是否成功。基于以前有人研究水浴浸泡法、酒精擦拭法、白熾燈烘烤法，但并未研究三頭線法及聯合法的成功率，本實驗將嘗試通過比較小鼠尾靜脈的四種不同注射方法，為研究者選擇合適的尾靜脈穿刺方法提供成功率更高的實驗依據。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

SPF級C57BL/6小鼠320只，6～8周齡，雌雄不限，體重約18～20 g，購自河北省實驗動物中心[SCXK (冀) 2013-0051]，飼養于河北省實驗動物中心(SPF級動物實驗室)[SYXK (冀) 2013-1-003]。

1.2 主要試劑與儀器

0.9%生理鹽水(石家莊四藥有限公司)，75%酒精(邯鄲市捷利康商貿有限公司)，純凈水(河北醫科大學第四醫院提供)。

一次性使用無菌胰島素注射器若干(江蘇萬邦生化醫藥股份有限公司，注冊標準YZB/USA 0355-2011)，1號、7號手術縫合線若干(河北省人民醫院手術室提供)，棉簽(新鄉市華西衛材有限公司)，超薄刀片(上海飛鷹刀片廠)，白熾燈(南皮亞明燈泡制造有限公司)。此外，還需自制小鼠固定器若干套進行動物的固定：自制小鼠固定器為50 mL塑料離心管，管蓋中心處打一圓形小孔，僅容尾巴露出。將小鼠放入自制小鼠固定器內，因小鼠較小，50 mL離心管相對活動空間較大，所以在離心管前方中上2/3處劃一道縫，可用硬卡片或者廢舊銀行卡堵于此處，以防止小鼠向前自由行走。此外，管壁上打少許小孔，以防小鼠窒息。

1.3 實驗方法

1.3.1 實驗動物分組

將320只小鼠隨機分成四組：空白組、白熾燈烘烤法組、三頭線法組、聯合應用法組，每組80只。

1.3.2 各組穿刺前預處理

(1)空白組：將小鼠放入自制固定器內，僅尾巴露出，無需任何特殊處理，固定好直接穿刺。見圖1A。

(2)白熾燈烘烤法組：將小鼠固定于自制固定器內，尾巴露出，用白熾燈照射小鼠尾部，同時用適當壓力按摩小鼠尾部。為避免加熱溫度過高及對小鼠身體進行照射，以遮擋物遮擋小鼠身體，減少刺激，以防止引起小鼠血液激素水平的改變，從而影響實驗結果。照射時間一般為8～10 min，照射結束后移去白熾燈，即可進行穿刺。見圖1B。

(3)三頭線法組：將小鼠固定于自制固定器內，僅尾巴露出，用7號縫合線于1號縫合線上打一外科結，再用1號縫線在7號縫線上打一外科結，形成固定十字交叉，剪斷1號線兩頭其中的一根，形成三頭線。先用7號縫合線在鼠尾根部打一活結，阻斷根部靜脈，擴張了背部靜脈血管，注射成功后由另一協助者協助向上提拉1號線，使結松開，避免了單根縫合線打結后解結的繁瑣程序，固定好即可穿刺。見圖1C。

(4)聯合應用法：將小鼠固定于自制固定器內，固定好小鼠，用白熾燈照射小鼠尾部，同樣以遮擋物遮擋小鼠身體部位，照射小鼠尾部時間一般為8～10 min，然后立即用三頭線在鼠尾靜脈根部結扎，不要太緊，迅速用酒精棉球在鼠尾靜脈擦拭2～3遍，用左手拇指和食指捏住鼠尾下1/3處，撐直尾巴，切不可用力過大，以防尾巴撐斷，以適當力使尾巴固定穿刺即可。當注射器穿入鼠尾靜脈后，這時可以讓協助者向上提拉1號線，松開結。見圖1D。

1.3.3 尾靜脈穿刺操作及成功標準

鼠尾左側或右側靜脈中1/3到下1/3，皮下組織相對較少，靜脈比較淺表，是穿刺取血的較好部位。本實驗由同一個操作者進行穿刺，另一個人協助操作。操作進行一段時間后，視體力情況稍事休息再繼續進行實驗。操作者用左手拇指和食指捏住鼠尾下1/3處，撐直尾巴，切不可用力過大，以防尾巴撐斷，以適當力使尾巴固定即可，中指頂于固定器尾蓋處，固定小鼠尾巴，防止擺動，右手持注射器，針尖斜面向上，以約10°角穿入小鼠尾靜脈，針尖約長2 mm，當針尖刺入約一半時，可以近乎平行的角度緩慢進針，進針3～5 mm，試推少許生理鹽水，若注射不通暢，則表明未在血管內，若血管變白，無阻力，表明在血管內，每只小鼠穿刺時間小于2 min。注射完畢后拔出針尖，并以棉簽壓迫穿刺點，3 d后觀察鼠尾是否出現局部腫脹、潰瘍及壞死現象，來判斷穿刺是否成功。所有實驗操作程序均經過河北省人民醫院實驗動物中心批準，并按照實驗動物使用的3R原則給予特定的人道主義關懷。

1.4 統計學方法

實驗結果用SPSS 13.0統計軟件進行分析。計數資料用卡方檢驗，以P< 0.05為差異有顯著性。多個樣本間多重比較用χ2分割法比較，比較α=0.05/(4×3/2×1) ≈ 0.008，以P< 0.008為差異有顯著性。

2 結果

四種方法鼠尾靜脈穿刺成功率如表1所示。通過組間兩兩比較可見：白熾燈烘烤法效果強于空白對照組(χ2=40.172，P< 0.001)；三頭線法較空白對照組、白熾燈烘烤法而言，穿刺成功率明顯提高(χ2=85.066，P< 0.001；χ2=12.745，P< 0.001)；與空白對照組、白熾燈烘烤法或三頭線法相比，聯合應用法提高了穿刺效率，且差異有顯著性(χ2=129.681，P< 0.001；χ2=41.243，P< 0.001；χ2=10.667，P=0.001)。此外，在穿刺過程中，白熾燈烘烤法組有1只因注射速度較快，出現心衰導致死亡，記為無效。

注：A：空白組；B：白熾燈烘烤法組；C：三頭線法組；D：聯合應用法組。圖1 各組操作示意圖Note.A: Blank group; B: Incandescent lamp baking method group; C: Three-line method group; D: Combined method group.Fig.1 Different devices used in four groups

表1 四種方法的穿刺成功率Tab.1 Puncture success rate of the four methods

3 討論

小鼠尾靜脈穿刺是采血、注射給藥等小鼠模型實驗的關鍵技術，聯合應用法成功率較其他三種方法靜脈注射成功率高，原因主要是不僅綜合了白熾燈烘烤法，而且采用三頭線阻斷根部靜脈回流，且注射后連續觀察3 d均未出現局部腫脹及壞死現象，大大提高了注射成功率。單用靜脈阻斷會降低其穿刺成功率，白熾燈烘烤法延長了靜脈擴張時間，方便操作者更好地注射，為其提供了更充分的時間，三頭線靜脈阻斷則是明顯擴張背部靜脈血管，避免了單根縫合線打結后解結的繁瑣程序，固定好即可穿刺，也避免注射針穿刺成功后解結所帶來的擺動性，避免穿刺失敗。李軼倞等[2]報道的籠蓋壓制法對于需多次重復的尾靜脈注射實驗不太適宜。另外需要注意的是：①注射時應注意注射速度，相關研究表明[3 - 4]，成年小鼠血循環的總容量約1.4 mL，鼠尾靜脈直徑平均小于(0.6±0.5) mm，每次注射的劑量不應超過0.2 mL，防止小鼠心衰；如果一旦出現小鼠心衰情況，立即停止注射，對小鼠實行心臟按摩。②因鼠尾靜脈血管管壁較薄，針頭進入及注射藥物時，手不要發抖，防止扎穿。③應先從鼠尾中下部位注射，若第一次失敗，可逐漸沿鼠尾靜脈走行向上進行穿刺。④穿刺過程中應手穩、心靜。⑤可先用超薄刀片將小鼠鼠尾背部兩側靜脈走行區尾毛蛻干凈，在蛻毛過程中，應從鼠尾根部以20°角自上向下蛻毛，切忌用勁過大，削破鼠尾，一般蛻毛應兩遍，可使穿刺視野更加清楚，提高穿刺成功率。⑥穿刺完畢后，應用棉簽壓迫止血，對于連續多次、多日的鼠尾靜脈注射，需注意尾部的消毒，防止感染。良好徹底的止血對于保護血管是非常重要的。⑦本實驗在注射時拇指、食指、中指的姿勢依據個人習慣，熟練掌握以后，也可一人操作完成，因數量較多，兩人操作較快，效率較高。⑧為避免人為刺激引起小鼠血液激素水平的改變，應避免加熱溫度過高[5]，還應保持實驗室內溫度在28℃左右，特別是冬季很有必要，因為適宜的室內溫度對小鼠尾靜脈也有一定的擴張作用，并且能夠使血流通暢，降低注射阻力。目前C57BL/6小鼠尾靜脈注射不同方法報道文獻較少，本實驗通過對比研究，得出聯合應用法穿刺成功率高，值得推廣。

參考文獻：

[1] 李富榮, 王新根, 鄧春艷, 等. 間充質干細胞聯合胰島移植對受體鼠T淋巴細胞亞群的影響 [J]. 免疫學雜志, 2010, 26(7): 606-611.

[2] 李軼倞, 張娜, 田楓. 一種簡易小鼠尾靜脈注射固定法——籠蓋壓制法 [J]. 中國比較醫學雜志, 2016, 26(10): 79-81.

[3] 余紹蘭, 馬躍榮. 實驗用小鼠尾靜脈穿刺的幾點體會 [J]. 瀘州醫學院學報, 2007, 30(4): 330.

[4] 蘇麗娜, 郭劍偉, 饒光玲. 小鼠尾靜脈注射與斷頭取血實驗技術的改進 [J]. 大理學院學報, 2010, 9(6): 25-27.

[5] 施文, 孫永強. 小鼠尾靜脈注射和采血簡易固定裝置的制作和使用方法 [J]. 免疫學雜志, 2011, 27(9): 807-808.