三種膠原纖維染色法評價宮腔粘連的比較

陳 醒，毛樂樂，周應芳*，白文佩(.北京大學第一醫院婦產科，北京 00034； 2.首都醫科大學附屬北京世紀壇醫院婦產科，北京 00038)

宮腔粘連(intrauterine adhesion，IUA)又稱Asherman綜合征，是由于各種原因導致的子宮內膜基底層破壞，進而產生瘢痕修復，造成的宮頸管或宮腔部分或完全閉鎖的一類疾病。宮腔粘連臨床上主要表現為月經異常(閉經和月經稀發)，繼發性不孕，復發性流產等。隨著人工流產和宮腔內手術數量的增加，宮腔粘連的發病率也不斷上升，嚴重影響了育齡期女性的身心健康和生活質量[1 - 2]。宮腔粘連的發生機制目前尚未完全闡明。我們根據宮腔粘連的發生機制，使用刀片機械性刮宮的方法制作了大鼠宮腔粘連模型，并通過病理學常用的纖維組織染色方法Masson染色、van Gieson染色和天狼猩紅(Sirius red)染色法來評價大鼠宮腔粘連的纖維化程度，并對三種方法進行組織學評價。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

本研究使用24只SPF級8周齡(成年)雌性SD大鼠，體重(210±10) g，購自北京維通利華實驗動物有限公司[SCXK (京) 2016-0006]，實驗動物合格證號：11400700197806。大鼠飼養于北京大學第一醫院實驗動物中心屏障動物實驗設施[SYXK (京) 2014-0010]，大鼠自由飲水和攝食，適應環境至少1周后開始實驗。無菌手術在北京大學第一醫院實驗動物中心屏障動物實驗設施內進行。

1.2 主要試劑與儀器

HE染色液購自北京中杉金橋生物技術有限公司，Masson染色試劑盒(甲苯胺藍)購自福州邁新生物技術開發有限公司，Masson染色試劑盒(亮綠)購自南京凱基生物科技發展有限公司，van Gieson染色試劑盒和天狼猩紅染色試劑盒購自北京雷根生物技術有限公司。主要儀器為倒置顯微鏡(ECLIPSE TS100，Nikon，Japan)和偏振光顯微鏡(DM4P，Leica，Germany)。

1.3 實驗方法

1.3.1 實驗動物模型制作

24只大鼠根據染色方法隨機分為4組，每組6只。大鼠使用10%水合氯醛麻醉后打開腹腔，找到“Y”型子宮，左側子宮切開后暴露宮腔，用刀片對子宮內膜進行搔刮，直至宮腔表面有粗糙感為止，6-0線縫合子宮，逐層關腹。右側子宮不做處理，作為對照。術后14 d取材，制作大鼠子宮組織石蠟切片。實驗方案經過北京大學第一醫院倫理委員會審批(編號：f201242)。

1.3.2 切片染色方法

(1)HE染色：①切片脫蠟至水；②蘇木精染色3～5 min；③自來水返藍15～30 min；④伊紅染色2 min；⑤梯度酒精脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片。

(2)Masson染色：①切片脫蠟至水；②Masson復合染色液滴染5 min，蒸餾水沖掉染液；③磷鉬酸染液滴染5 min，甩干；④滴加苯胺藍染色液(或亮綠染色液)染色5 min，蒸餾水沖洗；⑤滴加分化液分化30～60 s；⑥梯度酒精脫水、二甲苯透明、封片。

(3)van Gieson染色：①切片脫蠟至水；②天青石藍染色液染2～3 min；③水洗后Mayer蘇木精染液染2～3 min；④水洗后酸性乙醇分化液分化1～2 s；⑤自來水沖洗10 min；⑥麗春紅-苦味酸染液染1～2 min；⑦梯度酒精脫水、二甲苯透明、封片。

(4)天狼猩紅染色：①切片脫蠟至水；②天狼猩紅染色液滴染1 h，流水沖洗；③Mayer蘇木素染色液染細胞核8～10 min，自來水沖洗10 min；④梯度酒精脫水、二甲苯透明、封片。

1.3.3 切片分析

所有切片在光學顯微鏡下觀察。對于每種染色方法，每只大鼠子宮選取4個高倍鏡(high power field，HPF)(× 100)視野，計算子宮內膜腺體數目(個數/HPF)和子宮內膜纖維化面積比(膠原纖維面積占總子宮內膜面積的面積比)，使用Image Pro Plus 6.0進行分析。天狼猩紅染色切片在偏振光顯微鏡下觀察，以區分I型和III型膠原。

1.4 統計學方法

各染色方法的纖維化面積比和腺體計數采用t檢驗和方差分析進行分析，使用SPSS 22.0統計軟件，P< 0.05為差異有顯著性。

2 結果

2.1 HE染色

子宮組織HE染色結果顯示，對照組大鼠子宮內膜上皮，腺上皮和宮腔結構可見。刮除子宮內膜后，子宮內膜上皮和宮腔結構消失，代之以大量紅染的纖維組織(圖1)。

2.2 Masson染色

子宮組織Masson染色中的甲苯胺藍可將膠原纖維染成藍色，肌纖維和腺體上皮染成紅色。亮綠可將膠原纖維染成綠色，肌纖維和腺體上皮染成紫紅色，細胞核為紫色。刮除子宮內膜后，子宮內膜上皮和宮腔結構消失，代之以大量藍色或綠色的膠原纖維(圖2)。Masson染色(甲苯胺藍)對照組子宮內膜腺體數量(個數/HPF)為(10.04±0.50)，刮宮后為(3.79±0.27)，差異有顯著性(P< 0.01)；對照組纖維化面積比為(26.48±1.23)%，刮宮后的纖維化面積比為(52.06±1.46)%，差異有顯著性(P< 0.01)。Masson染色(亮綠)對照組子宮內膜腺體數量(個數/HPF)為(10.25±0.55)，刮宮后為(3.83±0.25)，差異有顯著性(P< 0.01)；對照組纖維化面積比為(21.23±0.91)%，刮宮后的纖維化面積比為(47.50±1.56)%，差異有顯著性(P< 0.01)。

注：A：對照組子宮，可見子宮內膜上皮和腺體，有宮腔結構，可見紅染的膠原纖維；B：刮宮后子宮，子宮內膜上皮消失，宮腔結構消失，有較多紅染的纖維組織。比例尺：50 μm。圖1 刮宮前后子宮組織的HE染色(× 100)Note.A: Control uteri. Cavity stricture, and endometrial epithelia and glands were observed. B: Scraped uteri. Cavity stricture and endometrial epithelia were absent, with red stained fibers observed. Scale bars=50 μm.Fig.1 HE staining of uteri before and after scraping

注：A：對照組子宮Masson染色(甲苯胺藍)，子宮內膜上皮、腺體上皮、肌層均染為紅色，膠原纖維為藍色；B：刮宮后子宮組織Masson染色(甲苯胺藍)，可見子宮內膜上皮和宮腔結構消失；C：對照組子宮Masson染色(亮綠)，子宮內膜上皮、腺體上皮、肌層為紫紅色，細胞核為紫色，膠原纖維為綠色；D：刮宮后子宮組織Masson染色(亮綠)，子宮內膜上皮和宮腔結構消失。比例尺：50 μm。圖2 刮宮前后子宮組織的Masson染色(× 100)Note.A: Control uteri (toluidine blue). Endometrium, endometrial glands and muscular layers were stained red while fibers were stained blue. B: Scraped uteri (toluidine blue). Endometrial epithelia and cavity stricture were absent. C: Control uteri (light green). Endometrium, endometrial glands and muscular layers were stained purple-red, the nucleus was stained purple, and fibers stained green. D: Scraped uteri (light green). Endometrial epithelia and cavity structure were absent. Scale bars=50 μm.Fig.2 Masson staining of uteri before and after scraping

2.3 van Gieson染色

van Gieson染色結果顯示，肌纖維、上皮胞質等非膠原纖維成分被染為黃色，細胞核為棕色或黑色，膠原纖維被染為紅色。刮除子宮內膜后，子宮內膜上皮層消失。對照組子宮內膜腺體數量(個數/HPF)為(10.29±0.40)，刮宮后為(3.71±0.25)，差異有顯著性(P< 0.01)。對照組纖維化面積比為(21.40±1.21)%，刮宮后的纖維化面積比為(47.49±1.54)%，差異有顯著性(P< 0.01)。

注：A：對照組子宮的van Gieson染色，子宮內膜上皮、腺體上皮、肌纖維被染為黃色，細胞核為棕色或黑色，膠原纖維染為紅色；B：刮宮后子宮的van Gieson染色，刮除子宮內膜后，子宮內膜上皮層消失。比例尺：50 μm。圖3 刮宮前后的子宮van Gieson染色(× 100)Note.A: Control uteri. Endometrium, endometrial glands and muscular layers were stained yellow, the nucleus was stained brown or black, and fibers stained red. B: Scraped uteri. Endometrial epithelia and cavity structure were absent. Scale bars=50 μm.Fig.3 van Gieson staining of uteri before and after scarping

2.4 天狼猩紅染色

天狼猩紅染色結果顯示，肌纖維、上皮胞質、細胞核等非膠原纖維成分被染為紫色，膠原纖維被染為紅色。刮除子宮內膜后，子宮內膜上皮層消失，子宮內膜腺體數量(個數/HPF)為(10.08±0.44)，刮宮后為(3.79±0.26)，差異有顯著性(P< 0.01)；對照組纖維化面積比為(20.17±0.69)%，刮宮后的纖維化面積比為(46.88±0.92)%，差異有顯著性(P< 0.01)。偏振光顯微鏡下，I型膠原呈亮紅色或強橙黃色，III型膠原呈綠色。對照組I型膠原在子宮組織中所占的面積比為(11.88±0.70)%，刮宮組為(32.68±1.17)%；對照組III型膠原在子宮組織中所占的面積比為(8.65±0.37)%，刮宮組為(17.32±0.69)%。差異均有顯著性(P< 0.01)(圖4)。

本研究的各種染色方法中，Masson染色(亮綠)、van Gieson染色、天狼猩紅染色計算出的對照組和刮宮組纖維化面積比均無明顯差異(P> 0.05)，但均顯著低于Masson染色(甲苯胺藍)(P< 0.01)。

注：A：對照組子宮的天狼猩紅染色，肌纖維、子宮內膜上皮、腺體上皮、肌層、細胞核被染為紫色，膠原纖維被染為紅色；B：刮宮后子宮的天狼猩紅染色，刮除子宮內膜后，子宮內膜上皮層消失；C，D：對照組(C)和刮宮后(D)子宮偏振光顯微鏡鏡下圖，可見亮紅色或強橙黃色的I型膠原和綠色的III型膠原。比例尺：50 μm。圖4 刮宮前后子宮組織的天狼猩紅染色(× 100)Note: A: Control uteri. Endometrium, endometrial glands, muscular layers, and the nucleus were stained purple while fibers were stained red. B: Scraped uteri. Endometrial epithelia and cavity structure were absent. C, D: Control uteri (C) and scraped uteri (D) under polarized light microscopy. Collagen type I ranged from orange to red, while collagen type III ranged from green to yellow. Scale bars=50 μm.Fig.4 Sirius red staining of uteri before and after scarping

3 討論

宮腔粘連的主要病理變化是子宮內膜組織的瘢痕修復及纖維化，異常增生的膠原纖維填塞宮腔。HE染色是最基本的組織學染色方法，但是其只能顯示最基本的病理變化，纖維組織為紅色，但是沒有特異性。膠原纖維含有堿性氨基酸，能與酸性染料進行結合而著色。Masson染色、van Gieson染色以及天狼猩紅染色都是利用此特點對膠原纖維著色。目前，上述染色方法主要用于各種纖維化疾病的研究中。

Masson染色法是經典的顯示結締組織的三色染色方法，光鏡下膠原纖維呈藍色(甲苯胺藍)或綠色(亮綠)，肌纖維、紅細胞被麗春紅染成紅色。由于操作步驟較為復雜，因此實際染色過程中，染色影響因素較多。Masson染色鏡下細胞核可以表現為黑色、褐色或藍色。因此，如果用甲苯胺藍染膠原纖維，在圖像分析時，容易將細胞核所在區域計入膠原纖維中，容易產生膠原纖維“過染”的假象，造成分析誤差[1]，而使用亮綠染膠原纖維則不會出現此現象，因此從該角度來看，亮綠可能比甲苯胺藍更適合染膠原纖維[2]。

van Gieson染色也是一種經典的膠原纖維染色方法。該法使用麗春紅將膠原纖維染為紅色，苦味酸將其他肌纖維等非膠原纖維部位染成黃色，天青石藍和蘇木精將細胞核染為紫色，因此在光鏡下較容易區分膠原纖維，計算纖維化面積時與Masson(亮綠)染色和天狼猩紅染色相比并無明顯差異，是一種較好的膠原纖維染色方法。

天狼猩紅是一種陰離子強酸性染料，每個分子內含有6個磺酸基，容易與膠原纖維中的堿性基團結合。天狼猩紅又是一種長形展開的分子，與膠原分子吸附后極穩定，染色后不易褪色。在普通光鏡下能使膠原纖維染成紅色，而非膠原纖維部分不見紅色背景。在偏振光顯微鏡下觀察，膠原纖維有正的單軸雙折射光的屬性，與天狼猩紅染液結合后，可增強雙折射，提高分辨率。在正常的子宮組織中，主要分布I型和III型膠原。在纖維化過程中，各種膠原纖維的量和構成比會發生顯著的改變，而這種改變與纖維化的程度密切相關。在纖維化過程中，I型和III型是主要參與的膠原纖維，其表達都增高[3 - 4]。在偏振光顯微鏡下，I型膠原顯示出很強的雙折光性，為亮紅色或強橙黃色；III型膠原雙折光性弱，為綠色，借此在鏡下可區分I型和III型膠原并使用圖像分析軟件進行定量分析[5]。雖然I型和III型膠原也可以通過其他方法如免疫組織化學、蛋白印跡法、聚合酶鏈反應等方法檢測，但所用抗體昂貴，操作繁瑣費時。天狼猩紅染色法則更為直觀、快捷、經濟。此外，本研究中使用的Mayer蘇木素染液，可將細胞核染為紫色，使染色更為清晰，并避免將細胞核染色計入膠原纖維中計算纖維化面積比。

天狼猩紅染色也有其他證據證實其比Masson染色效果更好。在一項肝纖維化研究中發現，天狼猩紅能夠顯示肝小葉周圍含量很小的膠原纖維，而Masson染色不能。該研究中同時發現天狼猩紅染色計算出的纖維化面積比也小于Masson染色的纖維化面積比，提示天狼猩紅染色對膠原纖維有更好的特異性[1]。在關于腎臟、心臟、肝臟纖維化的研究中，也有研究發現天狼猩紅染色法和Masson染色

法雖然都能顯示膠原纖維，但天狼猩紅染色能進一步區分膠原類型[6 - 9]。

在天狼猩紅染色過程中，也可以通過其他方法改進染色效果。如將天狼猩紅溶于飽和苦味酸溶液中并用乙醇分色，以降低背景染色，提高染色效率，使膠原纖維顯色更為清晰。也有報道在苦味酸-天狼猩紅染色液基礎上加入亮綠染色液后染色效果更強，對比更明顯[10]。

綜上所述，Masson染色法、van Gieson染色法在光鏡下也可用于觀察宮腔粘連組織中的膠原纖維及分布特征，但天狼猩紅染色法較Masson和van Gieson染色法不僅能夠反映宮腔粘連組織纖維化的分布，還在膠原纖維的分型中發揮重要作用。所以在實際工作中，天狼猩紅染色法具有更大的優勢。

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