應用環磷酰胺構建斷奶仔豬免疫抑制模型

鐘金鳳， 伍維高， 吳支要， 湯小朋

(1.湖南環境生物職業技術學院，湖南衡陽 421005； 2.湖南農業大學，湖南長沙 410000)

近年來，隨著生豬養殖的飛速發展，豬場仔豬的免疫抑制性疾病頻頻發生。這類疾病致使仔豬群處于免疫抑制狀態，不僅導致豬群疫苗免疫接種失敗，而且阻礙仔豬正常生長，給生豬生產帶來重大經濟損失。為進一步研究這類免疫抑制性疾病，構建穩定的仔豬免疫抑制模型模擬生產中免疫低下現象顯得尤為關鍵。

環磷酰胺(cyclophosphamide，簡稱CTX)，全稱P-[N，N-雙(β-氯乙基)]-1-氧-3-氮-2-磷雜環己烷-P-氧化物，是一種非特異性體液和細胞免疫毒性抑制劑[1]，是眾多的構建免疫抑制模型的藥物之一。因其作用機制復雜，用環磷酰胺構建免疫抑制模型時，沒有統一的標準。縱觀文獻，主要有3種指導方案，第一種是連續多次施藥，如馮焱等用0、40、80、160 mg/kg的劑量連續3 d腹腔注射1日齡的雛雞構建模型[2]；Harada等以15 mg/kg的劑量連續 5 d 腹腔內注射的方式構建豬的免疫抑制模型[3]。第二種是間隔多次施藥，如Huyan等采用50～200 mg/kg分2次注射，一次在第1天，另一次在第4天[4]。第三種施藥方式是單次用藥，Derbyshire采用100 mg/kg的劑量對5周齡無特定病原體仔豬腹腔注射構建免疫抑制模型[5]。文獻表明采用以上方式均能成功構建免疫抑制模型，但在實際生產中，多次施藥頗費人力物力，對動物應激大。如文獻所述，單次用藥效果理想，建議用單次用藥替代多次用藥，但未有文獻對此問題進行詳細研究。為此，本研究以斷奶仔豬為研究對象，擬采用等劑量的環磷酰胺單次用藥和連續用藥方式來觀察免疫抑制效果，為構建免疫抑制模型提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗動物與試劑

于2015年12月在湖南環境生物職業技術學院養殖場進行試驗。選取健康、體質量一致的杜×長×大三元雜交仔豬35日齡斷奶仔豬40頭，隨機分為A、B、C、D 4組，A組為對照組；B組環磷酰胺使用劑量為60 mg/kg，連續3 d注射；C組劑量為 90 mg/kg，從試驗第2天起，連續2 d注射；D組劑量為 180 mg/kg，試驗第3天一次注射完畢。對照組和試驗組未注射環磷酰胺時，注射等劑量生理鹽水，自由飲水和采食，試驗進行21 d。試驗所需環磷酰胺為江蘇恒瑞醫藥股份有限公司制造，批號14030525。紅細胞裂解液、FITC、PE-Cy5、PE標記的鼠抗羊的CD3、CD4、CD8抗體為eBioscience公司產品。

1.2 試驗日糧

基礎日糧參照NRC[6]仔豬營養需要配制成粉料，其具體配方及營養水平見表1。

表1 基礎日糧配方及營養水平(風干基礎，%)

注：預混料為1 kg全價料提供：維生素A 2 200 IU，維生素D3200 IU，維生素E 16 mg，維生素K 1 mg，膽堿200 mg，泛酸6 mg，維生素B22 mg，葉酸0.3 mg，煙酸25 mg，維生素B11.6 mg，維生素B66 mg，生物素0.08 mg，維生素B120.01 mg，Cu 6 mg，Fe 100 mg，Zn 100 mg，Mn 20 mg，I 0.14 mg，Se 0.3 mg。消化能根據原料組成計算所得，其余為實測值。

1.3 飼養管理

試驗仔豬采用群飼，飼喂干粉料，3次/d，時間為 08：00、14：00、18：00，每次以吃飽略剩料為宜，自由飲水。其他飼養管理和免疫程序按常規進行。

1.4 生長性能的測定

分別于試驗開始和結束當天的清晨進行空腹稱質量，計算平均日增質量；平均日采食量及料質量比；記錄腹瀉情況(每日在10：00和18：00觀察2次豬糞便情況，每次30 min，以糞便黏不成形和含水量≥70%視為腹瀉)。

1.5 白細胞和淋巴細胞計數

環磷酰胺注射完畢后的7、14、21 d，于清晨用EDTA無菌真空采血管從仔豬前腔靜脈采血2 mL，采用血細胞分析儀進行血細胞檢測。

1.6 流式細胞術測定淋巴細胞

100 μL EDTA抗凝血全血加入10 μL單克隆抗體(FITC-CD3，PE-Cy5-CD4，PE-CD8)，室溫下避光孵育20 min，加入紅細胞裂解液10 min后，于1 500 r/min速度下離心 5 min 后棄上清，加入1 mL磷酸緩沖液后離心，棄上清，細胞重懸于含有1%多聚甲醛的磷酸緩沖液中，用流式細胞儀計數。用標準的濾波器組合在488 nm波長的氬離子激光照射細胞，每個樣品共計10 000個淋巴細胞。

1.7 數據處理與分析

利用SPSS 16.0統計軟件中的One-Way ANOVA程序進行方差分析，用Duncan’s法進行多重比較。試驗結果采用“平均值±標準誤”表示。

2 結果與分析

2.1 生長情況的一般觀察

注射環磷酰胺的仔豬(B、C、D組)表現出嗜睡、乏力、不愿活動、被毛豎立、無光澤，且在注射藥物后第2～4天均有此類表現，第5～7天癥狀加重，第8～10天最為明顯，然后逐漸變好，至無異常表現。試驗組出現不同程度的腹瀉，其中B組有2頭仔豬因水樣便出現脫水，繼發感染伴高溫，分別于試驗進行14 d死亡，其余仔豬腹瀉自愈。

2.2 環磷酰胺對仔豬生長性能的影響

環磷酰胺對斷奶仔豬生長性能的影響見表2。B、C、D組的第21天體質量、平均日增質量、料質量比顯著低于對照A組(P<0.05)，B、C、D組間差異不顯著(P>0.05)。平均日采食量各組間差異不顯著(P<0.05)。

2.3 環磷酰胺對仔豬外周血白細胞數量的影響

環磷酰胺對仔豬外周血白細胞數量的影響，見表3。試驗B、C、D組7 d時的白細胞顯著低于對照A組(P<0.05)，B組顯著低于C組、D組(P<0.05)。14 d時，B組、D組顯著低于A組、C組，B組、D組間無差異(P>0.05)。21 d時，各組間無差異(P>0.05)。

2.4 環磷酰胺對仔豬外周血淋巴細胞數量的影響

環磷酰胺對仔豬外周血淋巴細胞數量的影響，見表4。7 d 時，B、C、D組顯著低于A組(P<0.05)，B組又顯著低于C組、D組(P<0.05)；14 d時，A組、B組、D組顯著低于C組(P<0.05)，A組、B組、D組間差異不顯著(P>0.05)；21 d時，A組、B組、C組顯著高于D組(P<0.05)，A組、B組、C組間差異不顯著(P>0.05)。

2.5 環磷酰胺對仔豬外周血淋巴細胞亞群的影響

環磷酰胺對仔豬外周血CD3+、CD4+、CD8+T細胞的影響，見圖1。隨著環磷酰胺的注射，仔豬CD3+、CD4+、CD8+T細胞在注射后7 d試驗B、C、D組顯著低于對照A組(P<0.05)，B組、C組、D組間差異不顯著(P>0.05)；14 d仔豬CD4+T細胞中，B組、C組、D組比A組顯著降低(P<0.05)；B組、C組、D組間差異不顯著(P>0.05)。21 d A組、B組、C組、D組間差異均不顯著(P>0.05)，試驗各組CD3+、CD4+、CD8+T細胞有所恢復。

表2 環磷酰胺對仔豬生長性能的影響

表3 環磷酰胺對仔豬白細胞的影響

注：#表示B組在21 d時只有8頭。下表同。

表4 環磷酰胺對仔豬淋巴細胞的影響

3 討論

3.1 環磷酰胺對斷奶仔豬被毛的影響

本研究肌肉注射環磷酰胺后3 d便觀察到試驗動物被毛輕微豎立，光澤度欠佳，停藥后得以逐漸恢復。Novotná等研究表明環磷酰胺用藥后3 d，雞毛囊真皮乳頭和基質細胞之間的暗帶呈現零亂皺褶狀，皺褶處附著致密的沉著物，沉著物內側充滿小突起[7]。真皮乳頭細胞周圍的膠原纖維排列紊亂，異染色質沿核膜邊緣集結，粗面內質網增多，毛球基質細胞間隙變小，甚至消失，相鄰細胞有橋粒連接，細胞核張力絲雜亂排列。如果采集試驗仔豬的皮膚和被毛，在顯微鏡下觀察其毛囊結構和鱗片排列情況，試驗結果將更加全面。

3.2 環磷酰胺對斷奶仔豬生長性能的影響

本研究發現，注射環磷酰胺組的料肉比和平均日增質量比對照組低，這與Han等的研究結果[8]有一致性。這與環磷酰胺對腸道上皮細胞的損傷有關，仔豬消化道各段從內向外可分為4層，即黏膜層、黏膜下層、肌層、漿膜層，最內層為黏膜層，黏膜層主要由上皮細胞和分散其間的杯狀細胞組成，是吸收營養物質的主要部位。黏膜上皮細胞間緊密連接，但不斷更新，其細胞周轉在所有組織中最高，大約3～10 d可從隱窩向絨毛移行，到達腸絨毛頂端并脫落，隨糞便排出體外，屬快速增殖組織。環磷酰胺分解物——去甲氮芥可引起組蛋白H2A的變異體H2A.X 和 P53的磷酸化， 引起DNA受損[9]。

機體中快速生長組織的DNA和蛋白質更新較快，因此受損嚴重[10]，所以對胃腸道的消化和吸收功能影響甚大。

3.3 環磷酰胺對仔豬外周血白細胞、淋巴細胞數量的影響

本研究發現，環磷酰胺可降低仔豬外周血白細胞和淋巴細胞，在7 d時表現尤甚。Harada等用環磷酰胺腹腔注射約克豬后，外周血白細胞和淋巴細胞在2～12 d顯著低于對照組[3]，本研究結果與之存在一致性。呈現此現象可能與成髓細胞有絲分裂活動受抑制和淋巴細胞尤其是B淋巴細胞有絲分裂靜止有關[11]；本研究中另一個值得注意的現象，即B、C組白細胞在21 d反彈性升高，顯著高于對照組，B、C組的淋巴細胞也存在類似的表現，即B、C組下降至最低處，然后反彈高于正常值，而D組的白細胞和淋巴細胞均緩慢上升，這與徐宏貴等的研究結果[12]有類似之處。這可能是由于少量多次的注射方式對造血功能損傷及抑制程度輕，對GO期造血干細胞殺滅作用弱，致使骨髓內殘存的造血干細胞迅速代償性增殖，促使淋巴細胞和白細胞數量迅速增加，并釋放到外周血中。而一次性大劑量注射環磷酰胺嚴重破壞了骨髓造血干細胞代謝池，使之代償能力受損，故回升緩慢[13]。

由此可見，小劑量多次注射對外周血淋巴細胞和白細胞的影響有較大幅度影響，而單次大劑量注射則影響平穩。

3.4 環磷酰胺對外周血T細胞亞群的影響

為進一步考察環磷酰胺對斷奶仔豬免疫抑制機理，本研究采用流式細胞術檢測外周血的CD3+、CD4+、CD8+T細胞百分含量，以探尋環磷酰胺對T細胞的影響。

CD3+是外周血中代表成熟T淋巴細胞最好標志物之一，CD4+是調節機體免疫功能最重要的樞紐細胞；CD8+亞群為免疫反應中的直接殺傷性細胞，CD3+、CD4+、CD8+細胞百分含量直接反應機體的免疫機能。本試驗研究結果表明，試驗各組CD3+、CD4+、CD8+在試驗7 d時顯著降低，與楊憲勇、李霞等的研究結果[14-15]一致，這可能是環磷酰胺通過死亡受體信號轉導通路Fas/Fas L介導細胞凋亡，引起成熟T細胞數目減少。第二種可能是通過Bax/Bcl-2(B淋巴細胞瘤-2相關X蛋白/B淋巴細胞瘤-2)介導的細胞凋亡，細胞脂肪變性與氧應激使Bcl-2相關X蛋白(bcl-2 assaciated x protein，Bax)合成增多且轉移至線粒體外膜形成同源二聚體，引起線粒體PT孔打開，釋放細胞色素C，誘發細胞凋亡；而分布于線粒體外膜的Bcl-2可與Bax結合，避免Bax同源二聚體形成，抑制PT孔開放，體現抗凋亡作用。CTX能顯著增加成年雄性Wistar大鼠心臟組織BaxmRNA表達水平(P<0.05)，而降低抗凋亡基因Bcl-2 mRNA表達(P<0.05)[16]。單劑量150 mg/kg CTX作用活體小鼠，第2天紅細胞生成受到影響，凋亡增大，細胞密度減少[17]。也可能是環磷酰胺依賴能抑制一種周期素依賴性激酶4(CDK4)，導致細胞停滯在G1期[10]，具體原因有待進一步研究。總之，環磷酰胺可抑制T細胞的成熟、增殖與分化。

4 小結

一定劑量的環磷酰胺可導致仔豬生長性能降低，改變免疫細胞濃度，就本試驗而言，少量多次(60 mg/kg 3 d和 90 mg/kg 2 d)和1次大劑量(180 mg/kg)能改變機體白細胞和淋巴細胞濃度，抑制T細胞的成熟、增殖與分化，具有免疫抑制作用，能構成免疫抑制模型。由于一次大劑量(180 mg/kg)操作簡便，且免疫抑制效果穩定，推薦使用。

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[1]鐘金鳳，方熱軍. 環磷酰胺免疫抑制機制及在動物模型上的應用[J]. 中國免疫學雜志，2016(10)：1541-1546.

[2]馮 焱，趙恒壽，劉佳斌，等. 環磷酰胺對肉仔雞免疫機能的影響[J]. 飼料博覽(技術版)，2007，19(10)：31-34.

[3]Harada K，Muramatsu M，Suzuki S，et al. Evaluation on the pathogenicity ofErysipelothrixtonsillarumfor pigs by immunosuppression with cyclophosphamide or dexamethasone[J]. Research in Veterinary Science，2011，90(1)：20-22.

[4]Huyan X H，Lin Y P，Gao T，et al. Immunosuppressive effect of cyclophosphamide on white blood cells and lymphocyte subpopulations from peripheral blood of Balb/c mice[J]. International Immunopharmacology，2011，11(9)：1293-1297.

[5]Derbyshire J B. The effect of immunosuppression with cyclophosphamide on an experimental porcine enterovirus infection in piglets[J]. Canadian Journal of Comparative Medicine，1983，47(2)：235-237.

[6]NRC. Nutrient requirements of swine[M]. 11th ed. Washington D C：National Academy Press，2012：40-47.

[7]Novotná B，Jelínek R. Mutagenic and teratogenic effects of cyclophosphamide on the chick embryo：chromosomal aberrations and cell proliferation in affected and unaffected tissues[J]. Teratogenesis，Carcinogenesis，and Mutagenesis，1990，10(4)：341-350.

[8]Han J，Liu Y L，Fan W，et al. DietaryL-arginine supplementation alleviates immunosuppression induced by cyclophosphamide in weaned pigs[J]. Amino Acids，2009，37(4)：643-651.

[9]Kumar D，Tewari-Singh N，Agarwal C，et al. Nitrogen mustard exposure of murine skin induces DNA damage，oxidative stress and activation of MAPK/Akt-AP1 pathway leading to induction of inflammatory and proteolytic mediators[J]. Toxicology Letters，2015，235(3)：161-171.

[10]Lee J，Lim K T. Protection against cyclophosphamide-induced myelosuppression by ZPDC glycoprotein (24 ku)[J]. Immunological Investigations，2013，42(1)：61-80.

[11]Mackie E J. Immunosuppressive effects of cyclophosphamide in pigs[J]. American Journal of Veterinary Research，1981，42(2)：189-194.

[12]徐宏貴，方建培，黃紹良，等. 環磷酰胺對小鼠骨髓造血干/祖細胞作用及機制研究[J]. 中國小兒血液與腫瘤雜志，2007，12(3)：106-110.

[13]馬增春，譚洪玲，肖成榮，等. 環磷酰胺損傷小鼠骨髓造血的機制[C]. 全國藥物毒理學會議，2007：332-333.

[14]楊憲勇. 應用環磷酰胺構建C57BL/6J小鼠免疫抑制模型[J]. 中國組織工程研究，2012，40(16)：7486-7489.

[15]李 霞，李殿俊，富東旭. 免疫抑制劑對小鼠胸腺及外周血、脾臟T淋巴細胞亞群的影響[J]. 哈爾濱醫科大學學報，2005，39(4)：325-326，330.

[16]Asiri Y A. Probucol attenuates cyclophosphamide-induced oxidative apoptosis，p53 and Bax signal expression in rat cardiac tissues[J]. Oxidative Medicine and Cellular Longevity，2010，3(5)：308-316.

[17]Juaristi J A，Aguirre M V，Todaro J S，et al. EPO receptor，Bax and Bcl-x(L) expressions in murine erythropoiesis after cyclophosphamide treatment[J]. Toxicology，2007，231(2/3)：188-199.