黃顙魚免疫球蛋白單克隆抗體的制備與特性

徐 洋， 藺凌云， 尹文林， 姚嘉赟， 潘曉藝， 袁雪梅， 沈錦玉

(農業部淡水漁業健康養殖重點實驗室/浙江省魚類健康與營養重點實驗室/浙江省淡水水產研究所，浙江湖州 313001)

黃顙魚(PelteobagrusfulvidracoRichardson)別稱昂刺、黃姑子、黃臘丁等，隸屬于鲇形目(Siluriformes)鲿科(Bagridae)黃顙魚屬(PelteobagrusBleeker)[1]，因其肉質細嫩、營養豐富、經濟價值高等特點，成為我國重要的養殖經濟魚類[2-3]。隨著黃顙魚養殖規模的擴大、養殖密度的提高、養殖環境的惡化及養殖管理的相對滯后，黃顙魚疾病的暴發日益頻繁，已成為制約黃顙魚養殖業健康發展的主要因素。要實現對病害的有效防治，必須借助漁用疫苗等免疫技術進行預防[4]。近30年來，國內外學者針對黃顙魚的分類、生物學特性、人工繁殖和養殖方式等做了大量研究工作[5-6]，但有關黃顙魚免疫學的研究還處于起步階段。現有文獻探討了幾種純化蛋白的技術在黃顙魚血清免疫球蛋白(IgM)純化中運用的可行性[7]，研究了IgM抗原刺激后的表達規律及在轉錄水平及蛋白水平的個體發育[8]，檢測了黃顙魚IgM重鏈基因在各組織中的表達情況以及經免疫刺激后的變化規律[9]，但尚未見黃顙魚免疫球蛋白單克隆抗體研制和應用的報道。因此，我們開展了黃顙魚血清IgM單克隆抗體的研究，試圖將單克隆抗體運用于黃顙魚體液免疫應答規律、病原診斷和疫苗開發應用等的研究。

1 材料與方法

1.1 材料

健康黃顙魚，購自浙江省湖州市東林鎮保豐黃顙魚養殖場，體質量(500±10) g；6～8周齡雌性BALB/c小鼠，購自浙江大學醫學院實驗動物中心；小鼠的骨髓瘤細胞SP2/0由揚州大學農業部重點實驗室惠贈。

1.2 主要試劑

RPMI-1640和胎牛血清，購自博士德生物工程有限公司；DMSO、HT、HAT和PEG4000，購自Sigma公司；TMB顯色液和辣根過氧化物酶標記羊抗鼠IgG，購自上海碧云天生物技術有限公司；Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Kit，購自Roche公司；Protein A HP柱，購自GE公司；其他生化試劑均為國產分析純試劑。

1.3 黃顙魚免疫球蛋白的提取

取健康黃顙魚尾靜脈采血，室溫靜置1 h，4 ℃過夜，次日4 000 r/min離心15 min，取上清液。血清加等體積生理鹽水稀釋后，緩慢加入pH值為7.0的飽和硫酸銨至30%飽和度，4 ℃靜置過夜，10 000 r/min離心30 min，取上清繼續加入飽和硫酸銨至最終飽和度為50%，同上處理，收集沉淀溶解于0.02 mol/L PBS(pH值7.4)，再經PBS 4 ℃透析脫鹽，獲得黃顙魚免疫球蛋白粗提液，-80 ℃保存備用。取黃顙魚免疫球蛋白粗提液1.0 mL，與HiTrap Protein A HP柱4 ℃結合3～4 h；用0.02 mol/L pH值為7.4 PBS以1.0～1.5 mL/min流速洗脫未結合蛋白至D280 nm<0.01；用0.1 mol/L pH值為3.0檸檬酸以1.0～1.5 mL/min流速洗脫結合蛋白，以200 μL/管收集洗脫峰，合并洗脫峰，用0.02 mol/L pH值為7.4 PBS 4 ℃ 透析過夜，-20 ℃保存備用；同時進行SDS-PAGE電泳分析。

1.4 BALB/c小鼠的免疫

取50 μg純化的黃顙魚血清免疫球蛋白與等體積弗氏完全佐劑充分乳化，背部皮下多點及腹腔注射BALB/c小鼠，首免后14、28 d各用等量抗原與弗氏不完全佐劑混合進行免疫，融合前3 d腹腔加強免疫1次。

1.5 細胞融合

細胞融合按常規方法[10]，取免疫小鼠的脾細胞與SP2/0細胞混合于融合管內，PEG-4000處理使細胞融合，將融合細胞加入裝有飼養細胞的96孔板，置37 ℃、5% CO2培養箱培養。

1.6 陽性雜交瘤的篩選與腹水制備

待融合細胞生長到培養孔面積的1/10時，取培養上清用間接ELISA法進行篩選，用純化的黃顙魚血清免疫球蛋白作為包被抗原，2 μg/mL，100 μL/孔，4 ℃過夜包被；10%小牛血清于37 ℃封閉3 h，用PBST洗滌3次，5 min/次；加入雜交瘤上清37 ℃孵育1 h，以SP2/0上清作為陰性對照，陽性對照為免疫血清；同上洗滌3次，加入1 ∶1 000辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG 37 ℃孵育1 h，100 μL/孔；同上洗滌3次孔加入TMB顯色液，100 μL/孔，于暗處反應30 min，加入2 mol/L硫酸溶液終止反應，50 μL/孔，讀取D450 nm值。經復測仍為強陽性的克隆用有限稀釋法進行亞克隆，克隆化至陽性率達100%，即可定株并凍存；雜交瘤細胞株經凍存、復蘇后取5×106對數生長期細胞腹腔接種BALB/c小鼠，10～14 d 后采集腹水，離心收集上清，-20 ℃保存備用。

1.7 單抗特性鑒定

1.7.1 亞級份測定 按Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Kit說明書進行。

1.7.2 腹水ELISA效價的測定 以2 μg/mL純化的黃顙魚免疫球蛋白包被酶標板，4 ℃過夜，封閉后加腹水抗體，腹水稀釋度為1 ∶103～1 ∶(2.187×106)，100 μL/孔，其余步驟同“1.6”節。

1.7.3 western-blot分析 黃顙魚免疫球蛋白經SDS-PAGE后，采用Bio-red微型電轉移系統進行電轉移，恒壓 15 V，轉移45 min。轉印完畢后NC膜用脫脂奶粉封閉1 h，PBST洗滌后與1 ∶1 000的腹水結合1 h，洗滌后與1 ∶1 000的辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠 IgG結合1 h，洗滌后DAB顯色，拍照記錄。

1.7.4 單抗靈敏度測定 純化黃顙魚免疫球蛋白起始濃度為2 μg/mL倍比稀釋至10 ng/mL，100 μL/孔，4 ℃包被過夜，封閉后加入1 ∶1 000腹水抗體，100 μL/孔，其余步驟同“1.6”節。

1.7.5 單抗特異性測定 收集黃顙魚、鲇魚、鰻鱺、鯽魚、草魚、鳊魚、鱸魚、鱖魚和白魚等淡水魚血清作為待檢抗原，各種血清1 ∶1 000稀釋后包被酶標板，一抗加1 ∶1 000腹水抗體，其余步驟同“1.6”節。

2 結果與分析

2.1 免疫原的制備與檢驗

按“1.3”節中所述的過程制備抗原，用核酸蛋白儀測定提純的抗原濃度為1 mg/mL。由圖1可知，SDS-PAGE凝膠電泳圖譜上可以看到2條清晰的蛋白帶，分別代表黃顙魚Ig的重鏈和輕鏈。計算和分析結果表明，黃顙魚血清IgM重鏈和輕鏈的分子量分別為73、30 ku。

2.2 細胞融合與篩選

經過篩選最終獲得能穩定分泌抗體的雜交瘤細胞2株，分別命名為B10-C3和F6-F2。

2.3 單抗效價與特性分析

由表1可知，2株單抗均為IgG2a亞類；腹水抗體效價為1 ∶(7.29×105)。由圖1可知，2株單抗能與轉印后的黃顙魚血清IgM發生反應，都是識別的重鏈區；單抗F6-F2對純化的黃顙魚免疫球蛋白的檢測靈敏度為20 ng，單抗B10-C3對純化的黃顙魚免疫球蛋白的檢測靈敏度為39 ng。

表1 單抗特性分析

2.4 單抗特異性測定

由表2可知，F6-F2和B10-C3僅與黃顙魚血清發生反應，與被試的其他血清均無任何交叉反應。

表2 單克隆抗體的特異性

注：“++”表示強陽性反應；“+”表示陽性反應；“-”表示陰性反應。

3 討論

要實現對黃顙魚病害的有效防治，推動黃顙魚養殖業健康發展，必須借助免疫技術進行疾病預防，而免疫防治的效果受諸多因素影響，要達到理想的免疫防治效果，需考慮黃顙魚自身免疫系統組成特點及免疫應答規律[11]。IgM是魚類體液免疫應答的重要組成部分，利用單克隆抗體研究魚類IgM是最常用的方法之一[12]。近20年來，國內外學者對魚類免疫球蛋白的單抗開展大量研究工作，制備了部分淡水魚[13-16]及海水魚類[17-21]血清IgM的單克隆抗體。本研究通過Protein A親和層析純化黃顙魚血清免疫球蛋白，進而制備了2株抗黃顙魚免疫球蛋白單克隆抗體B10-C3和F6-F2。根據SDS-PAGE的結果推測黃顙魚免疫球蛋白的重鏈和輕鏈分別為73、30 ku，與黃艷青等利用MBP親和層析純化黃顙魚血清IgM的分子量結果[22]相一致。

從單抗特異性試驗的結果可看出，這2株單抗高度特異，本研究共選取包括黃顙魚在內的9種不同魚血清進行測試，2株單抗僅與黃顙魚發生特異性反應，與其他8種魚血清都無交叉反應，其中包括和黃顙魚同為鲇形目的鲇魚。這一現象說明了鲇形目不同屬之間的血清Ig相似度較低。從單抗的靈敏度測定結果可知，單抗F6-F2對純化的黃顙魚IgM檢測靈敏度為20 ng，與歐洲鰻、南方鲇和鱖[23-25]等免疫球蛋白單抗的靈敏度進行比較，單抗F6-F2的靈敏度極高，今后可成為黃顙魚病原診斷和血清學調查的重要工具。

Western-Blot分析結果表明，2株單抗呈陽性反應，都識別于黃顙魚IgM的重鏈區，沒有獲得抗輕鏈的單抗。目前已報道的魚IgM的單抗大部分可以識別魚的IgM重鏈，僅少量可以抗輕鏈[26]，這與魚血清IgM分子的結構有關，由于其重鏈恒定區的氨基酸序列多且結構復雜，可提供多個抗原表位；而輕鏈上免疫表位少。

綜上所述，黃顙魚IgM單克隆抗體的制備有助于深入分析黃顙魚免疫球蛋白結構與功能，該單抗可廣泛應用于黃顙魚免疫應答水平監測和疫苗免疫效果的評價，為黃顙魚免疫學深層次研究奠定基礎。

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