養殖沙塘鱧爛鰓癥病原研究及最適治療藥物的篩選

趙彥華， 劉洪巖， 孫夢玲， 史楊白， 薛 暉

(江蘇省淡水水產研究所，江蘇南京 210017)

沙塘鱧屬(Odontobutis)別稱沙烏鱧、蒲魚、土布魚、沙鱧、虎頭魚等，隸屬于鱸形目(Perciformes)虎魚亞目(Gobioidei)塘鱧科(Eleotridae)，主要分布于長江中下游、錢塘江、閩江等水系[1]；沙塘鱧多生活于湖泊、河溝的靜水區或近岸淺水區，是一類小型底棲肉食性魚類[2]。該魚因味道鮮美、營養豐富、肉質細膩又少刺而廣受人們喜愛。近年來，隨著市場需求的不斷增長，沙塘鱧的人工養殖規模不斷擴大，并且已經在多個省市的養殖區開展了混養和套養；然而養殖規模的增大遠不及市場需求的增長，在生產該魚苗種過程中，生產單位不注重該魚種質資源管理，導致養殖成魚發生生長速度變慢、病害增加等種質退化現象[3]。沙塘鱧種質的退化以及養殖水質的惡化導致了沙塘鱧抗病力的下降，尤其是細菌性疾病的大量暴發，2016年7月在江蘇南京和揚中沙塘鱧養殖基地沙塘鱧暴發爛鰓癥，死亡率高達80%，給養殖戶造成了極大的損失。

筆者所在課題組多次趕赴發生病害的南京和揚中養殖基地采集病料，從采集回的病魚的鰓部和腸道等多處組織中分離細菌經培養獲得2株形態高度一致的病原菌，并對其進行了傳統生理生化指標檢測以及16S rDNA同源性分析，結果表明2株病原菌均為嗜水氣單胞菌。

1 材料與方法

1.1 材料采集

患病沙塘鱧采集于南京及揚中等地的養殖基地，采集時間為2016年7—8月，體長為6～9 cm，體質量為6～12 g；健康的沙塘鱧采集自江蘇省淡水水產研究所沙塘鱧繁育基地，平均體長為7 cm，平均體質量為8 g。

1.2 病魚癥狀及解剖觀察

選取癥狀明顯的患病沙塘鱧，觀察并記錄病魚可見的體表特征，用消毒乙醇進行體表消毒，嚴格按照實驗室無菌操作方法，剪開其腹部，觀察其腹腔內肝臟和腸道情況。

1.3 病原菌分離及顯微鏡鏡檢

選取典型癥狀病魚的鰓部及腸道進行劃線接種，接種于普通瓊脂平板培養基，28 ℃恒溫培養48 h，挑取形態特征一致的病原菌進行劃線分離純培養3次，隨后將分離到的病原菌接種于肉湯培養基4 ℃保存。將上述純培養后的細菌挑取單個菌落，進行細菌涂片，干燥固定后用革蘭氏染色法進行鏡檢，觀察細菌形態及染色特性。

1.4 溶血性試驗

將分離到的細菌培養的上清液加入到微量血凝板上，然后分別加入等量不同動物的1%紅細胞，于37 ℃恒溫培養箱放置1 h，觀察結果。

1.5 生理生化指標檢測

將分離純化后得到的病原菌接種于各種生化試劑，具體操作參照文獻[4]進行，以微量發酵管法進行葡萄糖產氣、V-P、甘露醇、水楊苷、七葉苷、硫化氫、阿拉伯糖、肌醇、蔗糖的生化試驗；常規法分別進行運動性、鳥氨酸脫羧酶試驗。氧化酶測定用試紙法，變紅者判為陽性。

1.6 序列同源性分析

1.6.1 DNA模板的制備 挑取典型的單個菌落，稀釋至 50 μL 的去離子水中，沸水浴5 min，然后4 ℃ 12 000 r/min離心15 min，上清即為模板DNA。

1.6.2 PCR擴增 按照廣譜細菌16S rDNA擴增引物進行PCR擴增，擴增引物為正向27F：5′-AGTTTGATCMT GGCTCAG-3′，反向1 492R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′進行擴增。PCR反應體系(25 μL)含：2.5 μL 10×PCR緩沖液(含Mg2+)，1 μL 10 mmol/L 4×dNTP，10 μmol/L正向和反向引物各0.5 μL，0.2 μLTaqDNA聚合酶(5 U)，0.5 μL模板，加入去離子水至25.0 μL。PCR反應條件為：94 ℃預變性 4 min；94 ℃變性15 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，30個循環；72 ℃延伸10 min。PCR擴增產物由上海生工生物工程技術有限公司進行純化和測序。

1.6.3 序列分析 測序后在GenBank數據庫中分別輸入2株病原菌測得的16S rDNA序列并進行Blast比對。

1.7 人工感染試驗

將健康的沙塘鱧置于水族箱暫養7 d，水族箱規格為 1 100 cm×500 cm×700 cm，水溫控制在28 ℃，日換水量為40%，按時投喂鮮活蝦苗并及時清理水族箱，設置4個試驗組和1個對照組，每組6尾魚，通過試驗“1.3”節至“1.5”節發現所得菌株各項指標均一致，因而挑選其中1株Y-S01(從鰓部分離獲得)為代表菌株進行試驗，將肉湯培養細菌原液倒入水族箱中，用滅菌槍頭將沙塘鱧體表皮膚劃傷后，放入水族箱中，保證劃傷部位接觸到病原菌，每次換水后補加細菌1次；對照組沙塘鱧則采用同樣的方法將皮膚劃傷后，放入等量體積的無菌肉湯培養基，正常飼養。通過連續14 d觀察試驗組和對照組，記錄沙塘鱧癥狀及發病時間，取發病沙塘鱧鰓部和腸道等部位進行病原菌的分離及鑒定。

1.8 藥敏試驗及最適藥物篩選

選取水產上常用抗生素，按照常規紙片進行試驗，培養溫度為28 ℃，參照文獻[5]的標準進行結果判定。依據藥敏試驗結果，挑選出藥敏性較高的藥物對試驗組發病魚進行分組治療。

2 結果與分析

2.1 病魚癥狀及解剖情況

病魚表現出攝食量減少、游動遲緩、常靜止不動漂浮于水面上，體表和腸道都出現不同程度的出血，鰓部和頭部潰爛，肝臟呈現土黃色，發病后死亡率極高。

2.2 病原菌分離及顯微鏡鏡檢

從病魚鰓部及腸道采集分離得到2株細菌，分別編號為：Y-S01和Y-C01，2株細菌經普通瓊脂培養后得到形態、大小及顏色高度一致的菌落，在普通瓊脂培養基上菌落呈現肉色或灰白色，形態為圓形，邊緣光滑，中央凸起。2株病原菌經革蘭氏染色后，均呈現紅色，形態一致，病原菌均呈現兩端鈍圓的短桿狀，單個或呈對排列，顯微鏡下拍照(圖1)。

2.3 溶血性試驗

分別選取等量的人O型、綿羊、小鼠、雞、鴨以及鯽魚紅細胞，2株細菌均能造成血細胞溶血，溶血程度見表1。

表1 溶血試驗結果

注：“+”表示溶血程度。

2.4 生化指標檢測

分別將2株病原菌進行生化試驗，試驗結果見表2。根據生理生化反應結果，可以初步判定分離得到的2株細菌為嗜水氣單胞菌。

表2 生化試驗結果

注：“+”表示產酸，“-”表示不發酵，“(+)”表示產酸產氣。

2.5 16S rDNA序列同源性分析

從患病沙塘鱧的腸道和鰓部分離的菌株PCR結果見圖2。GenBank中同源序列檢索結果顯示，2株細菌與嗜水氣單胞菌屬的16S rDNA序列自然聚類，與2株分離菌相似度最高的8個結果均同屬于嗜水氣單胞菌屬；另根據病原菌的顯微鏡鏡檢以及生化試驗結果，最終確定分離到的2株菌均為嗜水氣單胞菌。

2.6 人工感染

人工感染后，沙塘鱧于試驗6 d首次出現死亡，死亡高峰期為感染的9 d和10 d，至14 d試驗結束時，試驗組死亡率分別為70%、80%、75%、75%，癥狀與采集病魚相似，對照組沙塘鱧生長正常(表3)，在病魚鰓部和腸道等處再次分離病原菌，通過柯赫氏法則驗證。

2.7 藥敏試驗及最適藥物篩選

選取青霉素、卡那霉素、鏈霉素、諾氟沙星、慶大霉素、氯霉素等一共6種藥敏試驗片，分別采購自上海醫學化驗所及北京天壇藥物生物技術開發中心，藥敏結果見表4。結果表明，抑菌效果最好的為諾氟沙星，選取諾氟沙星對人工感染發病且未死亡的病魚進行治療，治療方法按照藥物使用說明書進行，4個試驗組發病的沙塘鱧投藥3 d后病魚精神轉好，7 d體表癥狀消失，進食較活躍，可以判定諾氟沙星對此次沙塘鱧的發病有較好的治療效果。

表3 沙塘鱧人工感染結果

表4 藥敏試驗判定標準與結果 mm

3 討論

嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)廣泛分布于池水、淤泥等自然環境中[6]，可以感染魚、鱉、鰻、牛蛙及蚌等水生動物，也可以感染人造成敗血癥，感染水生動物主要引起暴發性出血，局部感染導致爛鰓、赤皮等癥狀；嗜水氣單胞菌感染能夠引起水產動物大量死亡，給水產養殖業造成經濟損失。目前，盡管已有針對嗜水氣單胞菌的疫苗[7]，但由于該菌存在不同血清型[8]，致使免疫保護效果差或不穩定，因此，目前防治嗜水氣單胞菌主要采用抗菌藥物治療的方法為主。

傳統的細菌鑒定方法是根據細菌的生理生化特性，按照細菌鑒定手冊進行判斷；但是傳統的生理生化試驗操作繁瑣、耗時長且受主觀因素影響較大[9]。目前，最常用的鑒定方法是通過分子生物學的手段進行鑒定[10-11]，但是目前尚有多種細菌的完整16S rDNA序列未被測定，給鑒定結果的準確性帶來一定的影響，需要生化鑒定結果作為佐證[12]，同時同屬不同種間的16S rRNA基因通常具有很高的同源性，因此適用于屬及屬以上分類單位的親緣關系鑒定，對于親緣關系較近的細菌常因分辨率不夠而較難區分[13]。

本次試驗結合傳統的生理生化以及現代的分子生物學手段的方法來鑒定細菌，獲得了較為準確的試驗結果。對分離的細菌進行了藥敏試驗，選擇出具有較好抗菌效果的抗菌藥-諾氟沙星，并在實驗室條件下給藥，有著良好的治療效果，對實際生產有著很高的參考價值。提高養殖沙塘鱧的產量，不僅僅要注重細菌病的防治，還要注重養殖模式的改變，蝦、蟹池中混養沙塘鱧的生態養殖模式是當前水產養殖中發展養殖生產、規避養殖風險、提高養殖效益的一條必由之路[14]，通過蝦、蟹和沙塘鱧混養，達到抗病、高產的目的。同時在沙塘鱧的養殖過程中，應及時做好嗜水氣單胞菌病的防治工作，一旦發現應及時隔離并對養殖塘口進行消毒，從源頭上阻止該菌的傳播。

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