褐毛鐵線蓮花部結構的掃描電鏡觀察

王 非， 郭艷平， 王競紅， 張永勝， 李 強， 鄭 瑞

(東北林業大學園林學院，黑龍江哈爾濱 150040)

毛茛科(Ranunculaceae)是一個遍布全球的大科，有59屬2 500種[1]，毛茛科植物大多數是一到多年生草本，少有灌木和藤本，如鐵線蓮屬(Clematis)[2]。鐵線蓮屬植物所包含的花朵類型豐富，花萼形狀、顏色千變萬化，其雌雄蕊結構的形態特征是系統分類學中的重要依據。我國毛茛科專家王文采通過對鐵線蓮屬植物的深入研究，依據萼片由水平開展到向上直展和雄蕊從無毛到有毛的演化趨勢，將我國現有鐵線蓮屬植物劃分為9個組[3]。在孢粉學方面，國內宋之琛等已對少數種進行了光學顯微鏡的描述[4-5]，吳海燕運用掃描電子顯微鏡(SEM)對毛茛科部分植物花形態和柱頭式樣的發生和發育過程進行了觀察研究，結果表明，在鐵線蓮屬中，花萼與苞片具有同源性，鐵線蓮屬植物中出現的多于4枚萼片的現象是次生的[6]。

褐毛鐵線蓮(Clematisfusca)是毛茛科鐵線蓮屬的多年直立草本或藤本植物。在東北地區，花期為春末至秋初。褐毛鐵線蓮開花相對較早，花型別致，花量充盈且花期較長，開花期間同一株褐毛鐵線蓮上的花可接替綻放，可一直保持有花可賞，它為東北地區的園林垂直綠化增添了一種新的選擇可能性。但是，對于褐毛鐵線蓮花部顯微結構的研究至今未見報道。因此，本研究以露地栽培的褐毛鐵線蓮為植物材料，實地觀察褐毛鐵線蓮的花部雌雄蕊形態特征，同時對花粉、雌蕊及萼片進行掃描電鏡觀察，以期為其今后的繁育栽培提供相應的理論知識，進一步為鐵線蓮屬植物種質資源評價提供理論依據，為今后鐵線蓮屬其他植物在園林綠化上的應用起到一定的指導作用，并為相關研究奠定一定基礎[7]。

1 材料與方法

本試驗材料為從吉林省磐石市煙筒山移植的野生褐毛鐵線蓮，該植株已在哈爾濱市成功露地越冬，且生長良好。試驗地點設在黑龍江省哈爾濱市香坊區東北林業大學園林學院苗圃內，于2015年6月中旬在苗圃樣地內采集褐毛鐵線蓮的新鮮花朵，之后立即制樣，對其花粉、雌蕊及萼片進行掃描電鏡觀察。同時在樣地內選取典型代表植株進行實地觀察，確定雄蕊及柱頭的形態特征。每個試驗均重復3次。

1.1 花朵雄蕊及柱頭形態特征的觀察

在樣地內選取具有代表性的若干褐毛鐵線蓮植株進行標記，在盛花期采用放大鏡、鑷子等工具進行雌雄蕊的基本形態觀察。對柱頭的伸長、顏色變化、有無黏液的分泌、雄蕊的伸長、散粉順序等指標進行觀察。

1.2 花粉掃描電鏡的觀察

采集盛花期的新鮮花粉，均勻撒在制樣杯的雙面膠上，在SCD-005型濺射儀上濺射，之后放入FEI QUANTA200型掃描電鏡中掃描，最后觀察、拍照。使用該電鏡軟件(精度 0.01 μm)對20粒花粉進行測量，包括最大值、最小值(表示變化幅度)和平均值，以及極軸和赤道軸長度。花粉粒大小以極軸長(P)和赤道軸長(E)的乘積(P×E)來表示，用極軸長和赤道軸長的比值(P/E)表示花粉粒的形狀，P/E>1.6為長橢球形，P/E在1.3～1.6之間為橢球形[8]。拍攝花粉極面照片進行觀察，再在高倍顯微鏡(4 000倍)下觀察花粉紋理結構。

1.3 柱頭、花萼片掃描電鏡觀察

于盛花期取處于不同時期的新鮮花朵，將其柱頭和花柱粘在制樣杯的雙面膠上，3次重復，之后通過掃描電鏡直接觀察、拍照及測量。花萼片取具有典型代表性的花朵，截取花萼片的正反兩面直接粘于樣品臺上，噴金，之后置于電鏡下觀察。

2 結果與分析

2.1 褐毛鐵線蓮花朵形態特征

褐毛鐵線蓮花苞呈紫色或紅紫色(圖1-a、圖1-b)，初開時，花苞先由4枚花萼鑷合相交處綻開1個小口(圖1-c)，之后雌雄蕊隨著花開口角度的不斷擴大，向外進行伸長生長(圖1-d)。雌蕊先露出，1 d內整個雌蕊即可全部露出(圖1-e)，剛綻放出來的柱頭呈淺綠色且聚攏在一起(圖1-f)，之后變為黃白色，柱頭逐漸呈指狀分離，彎向雄蕊方向(圖1-g)，最后變為褐色萎蔫狀(圖1-h)。通常情況下，最初整個雌蕊高于周圍的雄蕊，之后隨著外輪雄蕊高度超過雌蕊，花藥進行開裂，1～2 d內先開始進行散粉。隨后內側雄蕊高度逐漸與雌蕊群等高，或超過雌蕊，然后進行散粉。在之后的2～3 d內花藥相繼開裂并授粉。在散粉進行的同時，花絲也逐漸伸展、直立，之后向心發育，環繞于雌蕊群之上。雌蕊生長到一定長度后，離生心皮由聚攏狀態轉而分離，頂端柱頭向外彎曲，最后其形態呈菊花狀分散(圖1-h)。柱頭頂部發育成小指形態，以期最大程度地接收花粉。

2.2 花粉特征

2.2.1 花粉的形狀與大小 在掃描電鏡下，褐毛鐵線蓮的花粉為單粒花粉，整個形狀為橢球形(圖2-a)，花粉的極面觀為三裂圓形，赤道面觀為紡錘形，表面具有3條萌發溝，是鐵線蓮屬中常見的三溝型花粉(圖2-b)。溝長平均為(24.29±1.95)μm，變化幅度為18.67～28.75 μm，長至近兩極，但是3條萌發溝在極面處不相交，它們將花粉劃分為3個部分，萌發孔不易被觀察到。溝寬平均為(0.81±0.28)μm，變化幅度為 0.36～1.33 μm，在溝的兩端不似溝中部向內側深陷，而是趨于平緩呈鈍圓形，溝沿部整齊不加厚(圖2-a)。褐毛鐵線蓮的花粉極軸平均長度為(28.90±1.37)μm，變化范圍為 26.67～32.5 μm。赤道軸平均長度為(20.98±2.28)μm，變化范圍為18.67～29.33 μm。花粉粒大小約為28.90 μm×20.98 μm，花粉極軸與赤道軸長的比值平均為1.39±0.12。

2.2.2 花粉表面紋飾 在掃描電鏡下，褐毛鐵線蓮的花粉外壁表面分布著細密均勻的刺狀凸起，且大小不一，萌發溝內也密生點狀突起，密集度大于花粉表面，花粉表面較為粗糙(圖2-a)。

2.3 柱頭與花柱

在掃描電鏡下，褐毛鐵線蓮的柱頭主要經歷3個不同形態時期，分別為花蕾期、盛花期和末花期。在電鏡下花柱整體為長圓柱形，頂端柱頭呈尖圓形，后期彎向外側。花柱及柱頭上密生許多纖長的茸毛，長短不一，形成包圍整個雌蕊的毛被，茸毛愈往頂部愈尖，有的茸毛底部扭曲，有的則直生(圖 3-a、圖3-b)。花柱頂部的茸毛(柱頭部分)一般短于底部的茸毛，花柱內部的茸毛一般短于外圍的茸毛。褐毛鐵線蓮受粉面較大，可由頂端沿著腹縫線向下延伸、漸次發育，最后呈長條帶狀分布于單個心皮向心的一側。

花蕾期柱頭與花柱表面的細胞呈不規則形狀(圖3-c)，在花蕾期花柱上已有乳突細胞形成(圖3-b)。花剛開放時，柱頭形態見圖4，此時花苞先緩慢地綻出1個小口，雌蕊從內部隨著花苞的綻放逐漸露出，這個時期在掃描電鏡下的柱頭與花柱仍未有花粉散落(圖4-b)。隨后花苞小口不斷擴大，整個雌蕊結構全部露出，初花期到來，初花期柱頭形態見圖5。與此同時，外側花藥也開始散粉，先有少數花粉散落到柱頭上，表明進入授粉狀態。在盛花期，花粉主要聚集于整個花柱的頂部柱頭上(圖6-a)，由頂部開始受粉面逐漸向中部延伸(圖6-b)。花柱下部也有花粉散落(圖6-c)。在末花期，柱頭上仍有較多花粉，在掃描電鏡下的柱頭沿腹縫線向兩側張開，可明顯看到中間部位的縫隙(圖7)，并且向花柱中下部延伸，受粉面逐漸延長擴大，花粉也隨之向下分布。此時柱頭已呈現萎蔫發黑的狀態，但仍具備一定的受粉能力。

褐毛鐵線蓮的柱頭主要集中在花柱頂部，受粉面由頂部逐次往下，這一點可由花粉的分布情況看出。褐毛鐵線蓮也存在腹縫線，由花柱頂部彎曲的一側向中央位置及花柱下部開裂，但是由于褐毛的整個雌蕊結構密被的茸毛及較多的花粉，阻擋了該結構被發現，在掃描電鏡下即使是最大的放大倍數也未能觀察到該結構。但是，從花粉在柱頭上的分布位置及掃描電鏡下對末花期的整個花柱的觀察中，可以清楚地得出褐毛鐵線蓮存在腹縫線結構的結論。

2.4 花萼片的掃描電鏡觀察結果

通過對花萼片的掃描電鏡觀察可知，電鏡下萼片的茸毛及氣孔器僅在背面分布，腹面相對較為光滑(圖8-a、圖8-b)。其背面的茸毛按照一定的方向進行排列，在具有明顯脈序的地方分布尤為緊密(圖8-b)。腹面的細胞呈不規則狀，排列緊湊(圖8-a)。氣孔器則普遍存在于背面，其形狀基本呈梭形，氣孔縫周圍由1圈厚實的類似唇形的細胞包圍。氣孔縫平均長度為18.19 μm，變化范圍在11.11～28.89 μm；平均寬度為3.79 μm，變化范圍在1.48～7.413 μm。氣孔大小為18.19 μm×3.79 μm，平均厚度為4.72 μm，變化范圍在2.78～7.41 μm。花萼片背面的兩邊緣處，分布著白色氈茸毛，肉眼可見其數量明顯多于中央部位的茸毛，但是其長度短于中央部位的茸毛(圖8-c)。

3 結論與討論

對花形態特征的觀察是深入認識植物繁殖器官生殖功能的首要條件[9]，了解雌雄蕊的外觀形態特征是觀察花內部發生發育的重要途徑。觀察發現，褐毛鐵線蓮的雄蕊數量較多，雌蕊由多數離生心皮構成。在發育過程中，單個心皮的柱頭頂端呈指狀膨大，花柱及柱頭均密生纖狀茸毛。褐毛鐵線蓮柱頭在成熟過程中，逐漸進行離心式發育，會隨著4枚萼片開口角度的擴大，柱頭逐漸伸長，達到一定程度后，柱頭部分開始向外翻卷彎向雄蕊的方向，從外觀上看，整個雌蕊部分呈菊花狀。其雄蕊最初低于整個雌蕊結構，之后隨著開花進程的推進，外輪雄蕊趕超過雌蕊，先進行第一輪的散粉，然后內側的雄蕊逐漸成熟，進行接下來的逐次散粉，整個散粉過程呈階段性進行。在實地觀察中，用放大鏡未觀察到柱頭表面有任何黏液類物質分泌，因此該柱頭屬于干柱頭。干柱頭在傳粉時不產生分泌物，但柱頭表面存在親水性蛋白質薄膜，能從薄膜下角質層的斷裂處吸收水分[10]。但是在其雄蕊基部有花蜜產生，且帶有淡香味。通過對褐毛鐵線蓮雌雄蕊形態特征及發育過程的初步觀察，可以為進一步的掃描電鏡觀察提供一定的形態依據，從而確定兩者之間的相互關聯性。

花粉是植物攜帶遺傳信息的雄性生殖細胞，其形態具有較強的遺傳保守性[11]，是植物系統分類學、研究進化分析和物種起源的寶貴資源、是花部綜合特征以及繁育系統研究中重要的組成部分[12-13]。褐毛鐵線蓮花粉的基本特征與吳海燕等研究的鐵線蓮屬部分植物的花粉形態特征相似，均為三溝型花粉，極面觀為三裂圓形，三孔溝，外壁密布刺狀凸起[6，8]，但是在花粉的大小、形狀及凸起狀態等方面存在差異。Santisuk研究了毛茛族124種植物的花粉，總結出毛茛族花粉有9種進化趨勢，其中萌發孔形態的進化順序是三溝—散溝—散孔；花粉外壁覆蓋層是從平坦—輕度波狀—強烈波狀變化的[14]。由此可知，褐毛鐵線蓮的花粉屬于較為原始的發育類型，該花粉表面較為粗糙，分布著均勻的刺狀凸起，這樣的結構符合蟲媒花花粉的特征。因為花粉表面比較粗糙，易于昆蟲足器等的黏附[15]。褐毛鐵線蓮花粉的形態特征有力地證明了它是以蟲媒為主要傳粉模式的類群。

植物為了接受花粉完成受精，進化出適應其花粉附著的柱頭形態及受精機制[16]。柱頭結構是花部構造中十分重要的組成部分，是接受花粉的場所。根據植物形態學的概念，構成雌蕊的單位是心皮。無論是合生心皮還是離生心皮，可以分化出下部能育的子房和上部不育的花柱，花柱上部擴展形成柱頭[6]。褐毛鐵線蓮的雌蕊就是由多數離生心皮組成的，其柱頭發育主要經歷3個發育階段，在花蕾期受粉面開始生成，在柱頭向心面開始有乳突細胞出現，為受粉活動進行相關的準備，之后柱頭的發育沿著腹縫線向兩側張開，進一步擴大受粉面。在末花期，可以清楚地看到腹縫線結構，同時可以觀察到整個茸毛的形成在花蕾期就已基本完成，茸毛沿著整個雌蕊的生長變形而變化，從底部一直密生到柱頭。初花期受粉開始進行，其受粉面的形成不是一次全部完成的，它是隨著花期的推移，受粉面不斷向花柱中部延伸，呈漸次發育的形式。這一點與吳海燕研究的鐵線蓮屬6種植物的柱頭發育過程[6]大體一致，這樣的柱頭發育方式，實際有效地延長了整個受粉時間，與此同時，外觀表象上延長了花朵的觀賞期。經比較后發現，褐毛鐵線蓮在頂端柱頭上密生纖長茸毛，這與目前所觀察到的其他種類的鐵線蓮存在一些差異，其他鐵線蓮的柱頭頂端疏生或幾乎無茸毛存在。而且褐毛鐵線蓮的花柱頂部(柱頭部分)的茸毛一般短于底部的茸毛，花柱內部的茸毛一般短于外圍的茸毛，這樣的茸毛構造更加有利于花粉的捕捉和延長花粉在柱頭上的滯留時間，在一定程度上為受粉的成功進行提供了保障。

經過實際觀察得知，褐毛鐵線蓮的雄蕊群散粉時間不具有統一性，往往是雄蕊群外側的花藥先進行散粉，由外至內地進行階段性散粉，這與柱頭受粉面的漸次發育相適應，保證了受粉面與花粉的同步性。其花粉的分布總是在柱頭及花柱向心的內側分布較多，并且是從頂端開始逐漸向下分布，頂端的花粉數往往最多。受粉面的延伸使得花粉著落面增加，提供了更多的受粉機會。Cruden等對19種蟲媒植物的研究表明，柱頭面積的擴大提高了傳粉效率[17]。并且雄蕊群內各個雄蕊的高度存在一定的差異，外層雄蕊高于內側的雄蕊，這有效地對整個雌蕊結構形成了包圍之勢。雌蕊結構在發育時逐漸由聚攏到分散，受粉面隨著分散的過程逐漸大面積地露出，這時內側雄蕊的花粉可以落在延伸出來的受粉面上，參差錯落的雄蕊結構更有利于受粉的進行，體現了其獨特的捕獲花粉的能力。

鐵線蓮屬的植物沒有花瓣結構的存在，往往是具有與花瓣相類似的萼片，其萼片較大且顏色鮮艷，呈花瓣狀，行使花瓣的功能去吸引昆蟲前來受粉。褐毛鐵線蓮的花萼屬于典型的厚萼型，花蕾期萼片最初的顏色為綠色，之后逐漸變為紫色，花萼背面的茸毛也逐漸增多。前人對鐵線蓮屬花萼片的研究多集中于其發生發育方面，關于其基本形態的研究報道則較少。因此本研究對褐毛鐵線蓮的花萼片進行了掃描電鏡的形態觀察，結果表明，在掃描電鏡下成熟期的花萼背面遍布皮孔器和濃密的茸毛，背面的邊緣被白色氈茸毛，腹面無皮孔和茸毛，表面比較光滑。背面相對粗糙，推測可能是便于昆蟲的停留，利于更好地進行受粉，并且密實的茸毛結構在一定程度上降低了風速的流動，這樣可以更好地減少水分的蒸騰。毛茛科植物中花瓣零星存在于不同類群中，一般而言，沒有花瓣的屬被認為是原始的[18]。由此可知，褐毛鐵線蓮萼片是相對比較原始的發育類型，保留了許多原始的特征。在實際觀察中可知，褐毛鐵線蓮花朵口徑較大，雌雄蕊暴露得也較為徹底，傳粉者可以輕松地進行授粉活動。受粉面的延伸、雄蕊數量眾多以及花萼的特殊結構為該種植物的繁殖提供了較為便利的條件。

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