丁烯基多殺菌素高產菌株的誘變選育及培養基優化

陳 爽， 趙 晨， 黎 琪， 王 超， 張曉琳， 張云鵬， 李金萍， 方 俊

(1.湖南農業大學生物科學技術學院，湖南長沙 410128； 2.國家糧食局科學研究院，北京 100037； 3.北京市植物保護站，北京 100029)

丁烯基多殺菌素(butenyl-spinosyns)[1-3]是由土壤放線菌須糖多孢菌(Saccharopolysporapogona)代謝產生的一類與多殺菌素結構類似、殺蟲機制相同的大環內酯類殺蟲劑[4-5]。其殺蟲譜比多殺菌素更為廣泛，對多殺菌素無法控制的煙青蟲[6]、蘋果蠹蛾、馬鈴薯甲蟲等均有較好的殺蟲活性[7-9]。其殺蟲機制與多殺菌素相同，通過作用于昆蟲的神經系統，致其非功能性的肌肉收縮、衰竭，并伴隨顫抖和麻痹，最終導致死亡[10-12]。此外，丁烯基多殺菌素比多殺菌素具有更多的衍生物，到目前為止，已檢測到30多種丁烯基多殺菌素衍生物[1]，丁烯基多殺菌素作為一種新型的生物農藥在防治害蟲方面有良好的應用價值和廣闊的市場前景。

通過理化誘變篩選丁烯基多殺菌素高產菌株和培養基優化是提高其發酵產量的主要方法[13]。目前，常規的誘變選育方法仍然是獲得高產菌株的有效手段之一[14-15]，其中亞硝基胍(nitroso-guanidin，簡稱NTG)是一種超誘變劑，應用廣泛，能與1個或幾個核酸堿基反應，引起DNA復制時堿基配對的轉換而發生遺傳變異[16]。本研究利用NTG對前期篩選到的ASAGF58菌株進行誘變，擬篩選丁烯基多殺菌素穩定高產突變株，并通過單因素試驗和正交試驗對高產突變株的發酵培養基進行優化，以期獲得高產丁烯基多殺菌素的配方。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試菌株 須糖多孢菌(S.pogona)ASAGF58由國家糧食局科學研究院發酵生物技術實驗室篩選和保藏。

1.1.2 生測幼蟲 埃及伊蚊(Aedesaegypti)由中國疾病預防控制中心提供。

1.1.3 培養基 產孢培養基：10.00 g/L葡萄糖，5.00 g/L酪蛋白胨，5.00 g/L酵母提取物，5.00 g/L牛肉膏，0.74 g/L CaCl2·2 H2O，15.00 g/L瓊脂，pH值為7.2。誘變種子培養基：30.0 g/L胰蛋白大豆肉湯，3.0 g/L酵母提取物，2.0 g/L MgSO4，10.0 g/L葡萄糖，pH值為7.2。誘變發酵培養基：64.80 g/L 葡萄糖，54.60 g/L糊精，15.00 g/L酵母膏，9.00 g/L 酵母提取物，15.00 g/L胨化牛奶，1.20 g/L(NH4)2SO4，3.00 g/L NaCl，0.05 g/L FeSO4，1.00 g/L K2HPO4，pH值為7.2。種子培養基：10.0 g/L糊精，30.0 g/L酪蛋白胨，3.0 g/L酵母提取物，2.0 g/L MgSO4·7H2O，0.5 g/L KH2PO4，pH值為7.2。發酵培養基：60.00 g/L葡萄糖，20.00 g/L玉米漿干粉，5.00 g/L NaCl，5.00 g/L CaCO3，1.02 g/L MgSO4·7H2O，pH值為7.2。以上培養基均于 115 ℃ 滅菌25 min。

1.1.4 主要試劑與儀器 CH3OH、CH3CN均為色譜純，均購自德國Merck公司；碳源均為分析純，均購自國藥集團化學試劑北京有限公司；氮源均為分析純，均購自英國Oxoid公司。

Waters 515/2487型高效液相色譜儀，購自美國Waters公司；全自動移液工作站epMotion 5070，購自德國Eppendorf公司；ISF12X恒溫恒濕搖床，購自瑞士Adolf Kuhner公司；HPS400生化培養箱，購自哈爾濱市東聯電子技術開發有限公司；離心機，購自德國Eppendorf公司；96孔細胞培養板，購自美國BD公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 制備孢子懸浮液 將出發菌株在產孢培養基上于 28～30 ℃ 培養6～8 d，用0.08%葡萄糖溶液沖洗斜面，用無菌竹簽將成熟孢子輕輕刮下，將孢子液移入含有玻璃珠的三角瓶中，振蕩。打散后的孢子液于孢子過濾器中進行過濾，收集孢子懸浮液在28～30 ℃孵育8 h，孢子萌發后用血球計數板計數，孢子懸浮液濃度約控制在108個/mL。

1.2.2 NTG誘變 取萌發好的孢子懸浮液分別分裝于含有2、3、4、5 mg/mL NTG溶液的Eppendorf管中，充分混勻，分別處理10、20、30、40、50、60 min后，于4 000 r/min離心10 min，收集菌體，用生理鹽水洗滌3次后，取100 μL孢子懸浮液進行10倍梯度稀釋涂平板，每個梯度設3個重復；取未經NTG誘變的孢子懸浮液進行稀釋涂布，每個稀釋度設置3個重復，作為對照組。將平板置于29 ℃培養6～8 d，形成單菌落。

1.2.3 生測初篩 向96孔板發酵液中加入2倍體積的甲醇浸提丁烯基多殺菌素，振蕩，4 000 r/min離心15 min，取 100 μL 上清液于新的96孔板中，避光條件下將有機溶劑揮發干凈，每孔加入100 μL去離子水復溶丁烯基多殺菌素，再向每孔加入5～8頭埃及伊蚊幼蟲，每隔1 h觀察記錄1次試驗結果。每組試驗設置3個重復[17]。

1.2.4 培養條件 96孔板種子培養：接種量為15%，溫度為29 ℃，搖床轉速為280 r/min，一級種子培養60 h，二級種子培養48 h。96孔板發酵培養：接種量為15%，溫度為29 ℃，搖床轉速為280 r/min，培養8～10 d。種子搖瓶培養：300 mL三角瓶接種量為10%，溫度為29 ℃，搖床轉速為240 r/min，培養48 h。發酵搖瓶培養：300 mL三角瓶接種量為10%，溫度為29 ℃，搖床轉速為240 r/min，培養7 d。

1.2.5 發酵液測定方法 丁烯基多殺菌素發酵產量的測定：取2 mL發酵液，加入4 mL甲醇浸提15 min，振蕩混勻，4 000 r/min 離心15 min，取1 mL上清液，12 000 r/min離心15 min，取上清液進行高效液相色譜(high performance liquid chromatography，簡稱HPLC)分析。HPLC分析條件：Waters515型高效液相色譜儀，安捷倫XDB-C18反向色譜柱，流動相中甲醇、乙腈、水的體積比為45 ∶45 ∶10(0.05%乙酸銨用水溶解后與有機試劑混合組成流動相)，流速 1.0 mL/min，檢測波長為244 nm。根據積分面積，計算產量。

生物量測定：取8 mL發酵液，4 000 r/min離心15 min，計算固體沉淀占發酵液的質量分數。

1.2.6 發酵培養基優化 單一碳源：以葡萄糖、乳糖、蔗糖、麥芽糖、甘露醇、糊精、甘油、可溶性淀粉等作為單一碳源，添加量均為60 g/L，基礎發酵培養基中其他組分不變。復合碳源：60 g/L葡萄糖分別與10、20、30、40、50 g/L可溶性淀粉、糊精、甘露醇等搭配。速效氮源：玉米漿干粉、胨化牛奶、酵母膏、牛肉膏；遲效氮源：以棉籽蛋白、大豆餅粉、大豆蛋白胨、酪蛋白胨、酵母提取物、乳清蛋白等作為單一氮源，添加量均為20 g/L，其他組分不變。復合氮源：20 g/L玉米漿干粉分別與20 g/L棉籽蛋白、大豆餅粉、乳清蛋白等搭配。正交試驗：將葡萄糖、糊精、玉米漿干粉、棉籽蛋白等進行4因素4水平正交試驗。

1.2.7 數據處理 數據采用Excel、Origin 8.0、SPSS 16.0 for Windows等軟件進行分析。

致死率=[(誘變前總菌落數-誘變處理后的總菌落數)/誘變前總菌落數]×100%；突變率=正突變率+負突變率。

2 結果與分析

2.1 NTG誘變對須糖多孢菌的作用

2.1.1 NTG對ASAGF58菌株的誘變效應 由圖1可知，不同濃度的NTG對ASAGF58菌株的致死率均隨著誘變時間的延長而增大，其中高濃度的NTG誘變效果明顯強于低濃度。據報道，致死率為80.0%～90.0%時，正突變菌株較多，致死率為90.0%～99.9%時，負突變菌株較多[14]。NTG濃度為2、3 mg/mL時，最大致死率不足50%，因此不進行統計分析。對ASAGF58菌株的正負突變率進行分析，由圖1、圖2可知，當NTG濃度為4 mg/mL時，誘變50 min時致死率為85%，此時正突變率最大，為29%；當NTG濃度為5 mg/mL時，誘變30 min時致死率為88%，此時正突變率最大，為25%，這與何新舟等的研究結果[14]一致。挑取1 500株單菌落經初篩、復篩后，得到28株丁烯基多殺菌素產量提高20%以上的突變菌株，7株產量提高30%以上的突變菌株。其中，7株高產菌株對應不同的NTG濃度和時間，說明NTG誘變對丁烯基多殺菌素產量的影響是隨機的。

2.1.2 高產菌株遺傳穩定性驗證 由于突變菌株自身攜帶修復機制以及遺傳不穩定性等特點，在進行菌種轉接過程中可能會出現表型延遲現象，導致突變株發酵產量下降[18]。因此，須要對篩選出的7株高產突變菌株進行遺傳穩定性驗證。由圖3可知，2-G4突變株轉接3、4次后丁烯基多殺菌素發酵產量與轉接2次相比，分別提高3.2%、1.08%；與轉接2次相比，9-H11突變株在轉接3次時產量下降5.3%，轉接4次時產量提高 10.53%，產量變化幅度超過10%，表明9-H11菌株的遺傳穩定性較差；此外，其余5個菌株與2-G4菌株相比相對產量較低。ASAGF58菌株經NTG誘變后篩選出1株發酵產量較高，且遺傳穩定的突變菌株2-G4(5 mg/mL NTG誘變50 min)，與出發菌株相比，其丁烯基多殺菌素產量提高86.7%。

2.2 發酵培養基優化

2.2.1 碳源篩選 碳源、氮源是培養基的重要組成部分，同時嚴重影響菌絲體生長及微生物次級代謝產物的產量。以高產菌株2-G4作為出發菌株，前期預試驗結果顯示，除葡萄糖、甘露醇外，突變菌株2-G4在其余幾種單一碳源培養基中丁烯基多殺菌素的產量均為0，而以葡萄糖作為單一碳源時，丁烯基多殺菌素發酵產量和生物量都優于甘露醇。因此，選擇葡萄糖作為碳源進行下一步的優化試驗。由表1可知，培養7 d后菌體的生物量均有所增加，尤其當葡萄糖與 30 g/L 糊精搭配時生物量達到最大值，為 6.53%；同時，大部分復合碳源發酵后均有利于丁烯基多殺菌素產生，其中當糊精加入量為50 g/L時，相對產量達到最大值，為111.6%，其次是糊精加入量為40 g/L時。可能是葡萄糖作為速效碳源，前期容易被菌體很好地吸收利用，而作為遲效碳源的糊精在發酵過程中緩慢分解成葡萄糖被利用。因此，選擇60 g/L葡萄糖和50 g/L糊精進行下一步培養基優化試驗。

2.2.2 氮源篩選 由表2可知，大多數單一有機氮源的添加均有利于2-G4突變菌株產丁烯基多殺菌素，特別是含有玉米漿干粉的培養基，突變菌株經發酵后丁烯基多殺菌素的相對產量最高，為110%，胨化牛奶作為氮源時次之。從菌體生長情況來看，以胨化牛奶作為單一氮源時所獲得的菌體生物量最高，為6.4%，玉米漿干粉次之。考慮到培養基成本等因素，發酵培養基中添加20 g/L玉米漿干粉對丁烯基多殺菌素的生成有明顯的促進作用。

由圖4可知，玉米漿干粉與棉籽蛋白、大豆餅粉搭配時，丁烯基多殺菌素的相對產量明顯高于它與乳清蛋白、胨化牛奶搭配時的產量。可能因為玉米漿干粉與棉籽蛋白、大豆餅粉搭配作氮源時，其氨基酸的種類及含量更適合丁烯基多殺菌素的產生。2-G4突變菌株在含棉籽蛋白的培養基中丁烯基多殺菌素的相對產量比含大豆餅粉的高8%，因此，選擇玉米漿干粉和棉籽蛋白作為復合氮源。

表1 不同碳源對菌體生長和丁烯基多殺菌素合成的影響

注：G代表60 g/L葡萄糖；S代表可溶性淀粉；D代表糊精；M代表甘露醇；字母下標數字代表相應的碳源含量，單位為g/L。以2-G4菌株在以葡萄糖作為單一碳源時丁烯基多殺菌素的產量作為100%。

表2 單一有機氮源對菌體生長和丁烯基多殺菌素合成的影響

注：以2-G4菌株在60 g/L葡萄糖、50 g/L糊精為碳源的基礎培養基中丁烯基多殺菌素的產量作為100%。

2.2.3 正交試驗 根據單因素試驗結果，設計4因素4水平的正交試驗。由表3可知，各因素對丁烯基多殺菌素生成的影響表現為C(玉米漿干粉用量)>A(葡萄糖用量)>B(糊精用量)>D(棉籽蛋白用量)。通過方差分析可知，突變菌株2-G4產丁烯基多殺菌素的發酵培養基最佳碳源、氮源組合為A3B2C1D4，即100 g/L葡萄糖、50 g/L糊精、20 g/L玉米漿干粉、80 g/L棉籽蛋白。驗證試驗表明，突變菌株在該培養基中丁烯基多殺菌素的產量比優化前提高52.1%。

3 討論

以ASAGF58作為出發菌株進行不同NTG濃度(2、3、4、5 mg/mL)和不同作用時間(10、20、30、40、50、60 min)的誘變，通過96孔板發酵培養結合生物檢測進行初篩、搖瓶復篩后，丁烯基多殺菌素產量提高30%以上的突變株有7株，經遺傳穩定性驗證后最終獲得1株高產菌株2-G4(5 mg/mL NTG誘變50 min)，與出發菌株相比，其丁烯基多殺菌素產量提高86.7%。其中，5 mg/mL NTG比其他濃度的致死率高，負突變率也相對較高，而正突變率偏低，但篩選出的高產菌株大多數來自該濃度，表明誘變效果與致死率、突變率無明顯相關性。說明NTG對丁烯基多殺菌素產量的影響是隨機的。

表3 正交試驗結果

注：以2-G4菌在優化后的培養基中發酵產量為100%。

以突變菌株2-G4為出發菌株，進行碳源、氮源單因素優化試驗，結果顯示，當培養基中加入葡萄糖、糊精、玉米漿干粉、棉籽蛋白時均能有效促進突變菌株的生長和丁烯基多殺菌素產量的提高。其中，葡萄糖作為速效碳源能被迅速分解利用參與生長代謝，糊精作為遲效碳源易被菌體水解為單糖后再利用，用于維持菌體代謝和產物合成；玉米漿干粉含有較為豐富的蛋白質和生長因子，作為速效氮源能有效促進菌體生長，而棉籽蛋白的添加更有利于生產丁烯基多殺菌素。在此基礎上進行4因素4水平正交試驗，得到優化后的發酵培養基配方為100.00 g/L葡萄糖、50.00 g/L糊精、20.00 g/L玉米漿干粉、80.00 g/L棉籽蛋白、5.00 g/L NaCl、5.00 g/L CaCO3、1.02 g/L MgSO4·7H2O，pH值為7.2。突變菌株2-G4在優化后的培養基中丁烯基多殺菌素的產量比優化前提高52.1%。

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