干旱脅迫對白刺花根尖細胞有絲分裂的影響

吳麗芳， 魏曉梅， 尹 輝， 顏岳輝， 李 通

(1.曲靖師范學院生物資源與食品工程學院，云南曲靖 655011；2.云南省高校云貴高原動植物多樣性及生態(tài)適應性進化重點實驗室，云南曲靖 655011)

種子是有性繁殖植物的重要繁殖器官，種子能否順利萌發(fā)及萌發(fā)初期長勢直接影響到幼苗的建成、存活、競爭和個體未來的適合度。而植物種子萌發(fā)、生長發(fā)育有賴于細胞數(shù)目的增加和細胞體積的擴大，細胞數(shù)目的增加主要通過細胞分裂來實現(xiàn)，如果細胞分裂周期過程中遇到不利的逆境，將直接影響到植物整個生命周期活動，這一過程中，又以早期萌發(fā)生長期最具典型和敏感性。

白刺花(Sophoradavidii)屬豆科槐屬落葉灌木，在我國主要分布在云南、四川、陜西、甘肅、山西、河北、河南、湖北、湖南、江蘇、浙江等地，具深根性、抗旱強等特點，是集藥用、食用、飼料、蜜源、水土保持、改良土壤、生態(tài)修復為一體的喀斯特山地優(yōu)良野生植物。云貴高原屬于典型的喀斯特地區(qū)，該區(qū)域石漠化現(xiàn)象日趨嚴重，且連年干旱的氣候促使生態(tài)系統(tǒng)岌岌可危。云南自2009—2012年出現(xiàn)了史無前例的旱情，且今后干旱環(huán)境將一直存在，給生態(tài)治理提出了嚴峻地考驗，從自然界中篩選抗旱植物，用于土壤、生態(tài)退化修復已收到了事半功倍的成效。干旱脅迫將導致植物一系列的連鎖反應，從對逆境的感知、傳導、轉(zhuǎn)錄因子控制到生理反應和形態(tài)結(jié)構(gòu)的改變，最終影響到植物的生長發(fā)育。目前已對白刺花抗旱性進行了多方面的研究，王慧慧等研究了干旱脅迫下白刺花種子大小與種子萌發(fā)的關(guān)系[1]；邵莉研究了白刺花干旱脅迫下生理相應機制及克隆了P5CS、DREB、DHN3個與抗旱相關(guān)的基因[2]；王海珍等研究了白刺花適應干旱的生理機理[3]；王紅梅等研究了干旱脅迫下白刺花幼苗的生理生化變化[4]；吳福忠等通過施用外源氮研究了干旱河谷白刺花幼苗生長、生物量及碳、氮、磷積累與分配的關(guān)系[5]；李芳蘭等研究了干旱脅迫下白刺花的形態(tài)和生理變化[6]。從現(xiàn)有資料來看，多數(shù)研究主要圍繞干旱環(huán)境下白刺花種子萌發(fā)、幼苗生長過程的形態(tài)及生理生化變化以及在分子水平上相關(guān)抗旱基因的克隆，而對于從細胞分裂基礎(chǔ)研究干旱脅迫下的遺傳損傷少見報道。基于此，本試驗在模擬干旱環(huán)境下，研究幼苗萌發(fā)過程中短期的干旱脅迫對白刺花根尖細胞染色體的分裂、結(jié)構(gòu)變化，為進一步開展抗逆生境的基礎(chǔ)研究提供更多的數(shù)據(jù)資料。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料于2014年10月在曲靖師范學院校園里采集，脫去外殼剔除有蟲害的種子后，實驗室自然風干保存于4 ℃冰箱中備用。

1.2 萌發(fā)試驗

將健康飽滿的種子用刀片劃破種皮后，用10%次氯酸鈉消毒20 min，無菌水沖洗4～6次后放入培養(yǎng)皿中發(fā)芽，發(fā)芽溫度27 ℃，黑暗培養(yǎng)。

1.3 干旱脅迫處理

待白刺花種子萌發(fā)至根尖長1～2 cm時，于08：00分別用0%、10%、20%、30%、40%、50%聚乙二醇(PEG-6000)脅迫處理6、12、24、48 h，每處理脅迫50顆小苗，脅迫完成后，迅速用蒸餾水涮洗根尖并將根尖取下，4 ℃冰箱低溫預處理24 h，放到卡諾固定液中固定24 h，之后轉(zhuǎn)入70%乙醇于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 有絲分裂染色體制片

染色體制片參照李懋學的方法[7]。將準備好的材料置于0.1 mol/L HCl中，60 ℃水浴解離10～15 min直至根尖軟化，用蒸餾水漂洗3～5次后，吸水紙吸干，放在載玻片上，用刀片剔除根尖最頂端根冠后，截取少許根尖分生區(qū)，用解剖針將其搗碎并均勻地涂開，滴1～2滴卡寶品紅染液，染色2～3 min，蓋上蓋玻片，用鉛筆輕敲并用吸水紙吸干水分，酒精燈火焰上輕輕烘烤，以利于細胞分散。

1.5 鏡檢及觀察統(tǒng)計

將制備好的裝片置于顯微鏡的載物臺上，先在低倍鏡(10×10)下找到分生組織區(qū)細胞分散均勻、分裂相較多的區(qū)域，再到高倍鏡(10×40)下觀察。每處理的根尖至少觀察10個裝片，每個裝片在高倍鏡下觀察和統(tǒng)計10個視野，記錄每個視野中觀察的總細胞數(shù)、分裂細胞數(shù)及各分裂相的比率。

1.6 干旱脅迫后觀察根尖細胞有絲分裂、微核、染色體畸變指標

測定計算的指標參照周錦雯的方法[8]。有絲分裂指數(shù)=處于分裂期的細胞數(shù)/總細胞數(shù)×100%；有絲分裂指數(shù)下降速度=-(有絲分裂指數(shù)T-有絲分裂指數(shù)t)/有絲分裂指數(shù)t×100%；染色體畸變率=染色體畸變細胞數(shù)/分裂細胞數(shù)×100%。其中，有絲分裂指數(shù)T表示處理時的有絲分裂指數(shù)；有絲分裂指數(shù)t表示同一時間處理下對照組的有絲分裂指數(shù)。微核率(micronucleus frequency，簡稱MNF)是指1 000個細胞中微核細胞數(shù)所占的比例。

1.7 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)用Excel和DYES軟件進行處理，單因素隨機區(qū)組試驗進行方差分析，LSR法檢驗各處理間的差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 干旱脅迫對白刺花根尖細胞有絲分裂的影響

由表1可知，隨著PEG-6000濃度的增加和處理時間的延長，白刺花根尖細胞有絲分裂表現(xiàn)出不同的差異。低濃度PEG-6000≤10%時，在處理6～12 h內(nèi)，同一時間處理下與對照差異不顯著；0～6 h短期處理下，對白刺花根尖細胞有絲分裂有一定的促進作用，有絲分裂指數(shù)從8.78%上升至 9.09%。隨著脅迫濃度的增加，其濃度>10%后，有絲分裂細胞減少，表現(xiàn)出了一定的抑制效應。尤其當濃度達到50%時，脅迫6 h時的細胞分裂指數(shù)為3.14%，而當脅迫48 h后，有絲分裂指數(shù)僅1.96%，可以非常明顯地觀察到幾乎所有細胞都已停止了分裂。結(jié)果表明，PEG-6000干旱脅迫對白刺花根尖細胞有絲分裂的影響不僅與處理時間有關(guān)，而且與處理濃度也有密切關(guān)系，是二者共同作用的結(jié)果。

注：同列數(shù)據(jù)后不同小寫字母、大寫字母分別表示在0.05、0.01水平上差異顯著、極顯著。表3、表4同。

植物根尖細胞分裂指數(shù)的大小反映了植物生長發(fā)育的狀況，同時也反映出細胞分裂活性的高低。從表2中可以看出，隨著處理時間的延長和處理濃度的增加，有絲分裂指數(shù)下降速率明顯在上升。當處理時間為6 h、處理濃度10%時，有絲分裂指數(shù)下降速率為-3.53%；當濃度增加至50%，有絲分裂指數(shù)下降速率為64.24%；當處理時間為48 h、濃度為50%時，有絲分裂指數(shù)下降速率最大，為78.32%。從整個變化趨勢來看，細胞有絲分裂能力隨處理時間的延長和濃度的升高不斷降低。

2.2 干旱脅迫對白刺花染色體畸變的影響

由表3可知，染色體畸變率高低與處理濃度和處理時間呈正相關(guān)。當處理時間為12 h、PEG-6000濃度≤10%時，與對照處理差異顯著；當處理時間超過12 h，各濃度處理與對照差異極顯著。當處理濃度>30%時，白刺花根尖細胞染色體畸變率均超過10%，尤其當濃度為50%、處理48 h時染色體畸變率高達16.05%。結(jié)果表明，染色體畸變率與處理時間、處理濃度均有關(guān)系。

表2 干旱脅迫對白刺花根尖細胞有絲分裂指數(shù)下降速率的影響

染色體畸變率往往通過多種類型而表現(xiàn)，在本試驗中，可以觀察到染色體斷片、落后染色體、染色體橋、多極分裂、染色體濃縮等(圖1至圖7)。通過研究觀察，染色體斷片是最常見的畸變類型，染色體斷片通常是由于在理化因素的作用下1個染色體發(fā)生1處或多處斷裂而不重接且無著絲粒的節(jié)段，如果染色體丟失片段比較大，或丟失片段上載有控制性狀的主基因，將會不可逆地導致細胞或生物體死亡。染色體橋是染色體發(fā)生斷裂，帶有著絲粒的2條染色體再經(jīng)重接，當2個染色單體后期向兩極分開，二者兩臂仍粘連在一起所形成的。落后染色體的產(chǎn)生有2種，一種是細胞有絲分裂前中期，染色體不規(guī)則排列在赤道板上時，有個別染色體或染色體片斷未能按時到達赤道板的位置；另一種是細胞有絲分裂后期，正常細胞的染色體都移向兩極，而個別染色體或染色體片斷滯留于兩極之間，與染色體的主體部分移向兩極的速度和進程不同而形成的。落后染色體經(jīng)細胞分裂，可能隨機趨向于細胞分裂的一極，也可能隨細胞的分裂而丟失。

表3 干旱脅迫對白刺花根尖細胞染色體畸變率的影響

2.3 干旱脅迫對白刺花根尖細胞微核的影響

微核也是染色體畸變的一種形式，早期微核技術(shù)主要用于水質(zhì)的檢測方面。微核位于細胞質(zhì)中，直徑是主核的1/20至1/3，是完全與主核分開的圓形或橢圓形的小核。從表4可以看出，當PEG-6000濃度小于20%時，微核率在10‰以下；當PEG-6000濃度高于20%后，微核率均大于10‰，尤其當濃度達到50%時，處理48 h的微核率最高，達15.76‰。早期研究認為，微核僅出現(xiàn)在細胞分裂的間期，后來經(jīng)過多年研究發(fā)現(xiàn)，細胞分裂的任何時期都能產(chǎn)生微核，且微核的大小與處理時間、處理濃度有關(guān)。本試驗中也觀察到不同分裂時期的微核(圖8至圖11)。

表4 干旱脅迫對白刺花根尖細胞微核的影響

3 討論

PEG-6000作為一種滲透調(diào)節(jié)劑，它能模擬干旱逆境的原因是其可阻塞植物的輸導組織。Kaufmann等研究得出，PEG-6000誘導水分逆境所取得的效果與土壤干旱是一樣的，PEG-6000誘導下引起植物內(nèi)源激素如ABA積累，而植物根部對ABA的反應最為敏感，從而導致植物生長受到抑制[9]。再者干旱脅迫下植物由于脫水使膜的構(gòu)成或結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，導致質(zhì)膜透性增加，細胞膜系統(tǒng)遭受破壞。在對小麥[10-11]、柑橘[12]、番茄[13]等研究中發(fā)現(xiàn)干旱脅迫下植物細胞破裂、內(nèi)溶物溢出，多數(shù)葉綠體溶解散亂在基質(zhì)中，細胞保護酶系統(tǒng)發(fā)生顯著變化。在抑制植物生長方面，干旱脅迫可能降低與DNA合成有關(guān)的酶活性，致使DNA的合成速率減慢，細胞分裂的間期延長[14]。本研究也觀察到，白刺花根尖細胞有絲分裂指數(shù)隨著PEG-6000處理濃度升高和處理時間延長明顯下降。短期(6 h)低濃度(PEG-6000濃度10%)有一個上升趨勢，這可能是植物短期內(nèi)適應環(huán)境變化的應激反應，使相當一定時期內(nèi)代謝增強，細胞周期加快導致，而當植物自身應激反應超過防御保護屏障后，植物的生長發(fā)育就會受到影響，甚至死亡，從而導致細胞分裂能力降低。

染色體畸變是植物細胞有絲分裂過程中受到理化因素的影響，DNA或蛋白質(zhì)的合成受到干擾，諸如紡錘體蛋白等與染色體運動有關(guān)的生物分子不能合成或合成量不足，或染色體損傷后不能及時正常修復而導致[15]，有染色體橋、染色體斷片、細胞多極化等畸變類型。本研究中，PEG-6000濃度 0～20%、處理24 h內(nèi)時，白刺花根尖細胞染色體畸變率在10%以下，當濃度大于30%時，染色體畸變率均在10%以上。本試驗中，觀察到了染色體斷片、染色體橋、染色體多極化、染色體濃縮等多種類型的畸變，其中染色體斷片是主要的畸變類型。染色體濃縮可能是長時干旱脅迫致使細胞合成代謝受阻，抑制微管蛋白的組裝，抑制調(diào)控細胞分裂的各種酶類的活性，使染色體被原位抑制而縮短變粗導致的。如在某些熱擊研究中，細胞在熱激處理下合成熱激蛋白，而熱激也可能導致染色體的快速濃縮。

微核是染色體畸變的一種形式之一，可能是染色體發(fā)生斷裂或部分落后染色體在細胞分裂的后期行動滯后，不能進入子細胞的主核而成[16-17]。微核多出現(xiàn)于細胞分裂的間期，但在細胞分裂的前期、中期、后期均能看到，而末期微核數(shù)微乎其微。

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