黃芩拆分組分對正常大鼠物質代謝、能量代謝、內(nèi)分泌系統(tǒng)及植物神經(jīng)系統(tǒng)的影響*

張亞男，陳平平，王洪玉，高 鑫，劉樹民

（1.黑龍江中醫(yī)藥大學中醫(yī)藥研究院，哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫(yī)藥大學藥物安全評價中心，哈爾濱 150040）

黃芩為唇形科植物黃芩（Scutellaria baicalensis Georgi）的干燥根，2015版中國藥典記載黃芩味苦性寒。歸肺、膽、脾、大腸、小腸經(jīng)[1-5]。

中藥的四性（四氣）是指中藥溫熱寒涼4種不同的藥性，但也有一部分中藥藥性平和，故現(xiàn)在四氣一般指“寒、熱、溫、涼、平”5種藥性，它反映了藥物影響人體陰陽盛衰、寒熱變化方面的作用趨勢[1]。基于此本實驗檢測大鼠體內(nèi)物質代謝、能量代謝、內(nèi)分泌系統(tǒng)、植物神經(jīng)系統(tǒng)相關酶的含量，考察黃芩拆分組分對其表達的影響，以初步詮釋黃芩拆分組分的寒熱屬性。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 取SD種雄性大鼠50只，SPF級，體質量（200±20）g，動物由黑龍江中醫(yī)藥大學藥物安全性評價中心提供[許可證號:SCXK（黑）2015-004]，室溫為（22±1）℃，相對濕度為（65±5）%，實驗動物自由攝食飲水。將大鼠隨機分成5組，空白組，全成分組、苷元組、苷類組、多糖組，每組10只。

1.2 藥物 黃芩生品[河北承德藥材有限公司（生產(chǎn)批號:20140623）]。黃芩拆分組分的制備:黃芩飲片加石油醚（料液比 1∶6）超聲 50 min，2 次，抽濾。合并濾液減壓濃縮，揮去石油醚得揮發(fā)油組分；藥渣干燥后，水煎煮，第1煎加入10倍量的蒸餾水提取，第2煎加入8倍量水（兩煎均冷凝回流2 h）,合并兩煎藥液，減壓回收提取液至適當濃度，得到全成分。加入95%乙醇（大約5倍量體積），不斷攪動，至乙醇的濃度約為80%，靜置24 h（此過程反復3～4次），收集沉淀部分，沉淀經(jīng)抽慮，離心后，經(jīng)無水乙醇，乙醚交替洗滌，自然干燥沉淀得多糖組分；濾液減壓回收至無醇味，過D101大孔樹脂，用3倍柱體積的30%乙醇和95%的乙醇進行洗脫，分別得到黃芩苷元組分和苷類組分，縮至稠浸膏，凍干，干燥保存待用。

1.3 試劑與儀器 葡萄糖激酶（GCK）、果糖磷酸激酶（PFK）、乙酰輔酶 A（Ac-CoA）、丙酮酸脫氫酶（PDH）、檸檬酸合酶（CS）、異檸檬酸脫氫酶（ICD）（南京建成生物工程研究所，批號20150610）、腺甘酸激酶（ADK）、ATP合成酶（ATPs）、細胞色素 C 還原酶（CCR）、細胞色素 C 氧化酶（COX）（南京建成生物工程研究所，批號20150617）、三碘甲狀腺原氨酸（T3）、四碘甲狀腺原氨酸（T4）、5-羥色胺（5-HT）、乙酰膽堿（AchE）、去甲腎上腺素（NE）酶聯(lián)免疫試劑盒、超微量Na-K-ATP酶測試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號20150624）。

酶標儀M200 PRO（奧地利）；AL204電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）；TGL-20M高速臺式冷凍離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司）；移液槍（德國梅特勒-托利多）；水浴鍋（北京市長風儀器有限公司）。

2 實驗方法

2.1 動物的分組及給藥 動物適應性喂養(yǎng)3d以后，隨機分為空白組、全成分組、苷元組、苷類組、多糖組，每組10只。全成分組給予（生藥3 g/kg），苷元組（生藥 0.05 g/kg），苷類組（生藥 0.41 g/kg），多糖組（0.42 g/kg），空白組給予等劑量生理鹽水。連續(xù)給藥2周后取心臟、肝臟、肌肉等迅速凍存于液氮中，轉移至-80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 物質代謝相關指標的檢測 取出之前凍存的肝臟組織解凍后，取剪碎的組織 0.2 g，按照 1∶9 的質量體積比，加入1.8 mL的生理鹽水，加入玻璃勻漿器中，于冰上充分研磨，最后將勻漿液以4 000 r/min，離心10 min，依據(jù)試劑盒說明書檢測GCK、PFK、PK、Ac-CoA、PDH、CS、ICD、的含量。

2.3 能量代謝相關指標的檢測 操作方法如上，依據(jù)試劑盒說明書檢測 ADK、ATP、CCR、COX、Na-KATP酶（肌肉）、Na-K-ATP酶（肝臟）的含量。

2.4 內(nèi)分泌系統(tǒng)相關指標的檢測 取材后的全血樣品于室溫放置2 h或者4℃過夜后以3 000 r/min離心15 min，取上清液，依據(jù)試劑盒說明檢測T3、T4的含量。

2.5 植物神經(jīng)系統(tǒng)相關指標的檢測 操作方法如2.4，依據(jù)試劑盒說明檢測 5-HT、AchE、NE 的含量。

2.6 統(tǒng)計方法 采用SPSS 22.0進行統(tǒng)計處理，實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD法，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 黃芩拆分組分對正常大鼠物質代謝的影響

3.1.1 黃芩拆分組分對葡萄糖氧化成丙酮酸階段相關酶表達情況的影響 見表1。實驗結果所示，與空白組比較，全成分組大鼠GCK、PFK的表達下調且具有統(tǒng)計學差異（P＜0.05）；苷元組 GCK 顯著下調（P＜0.05）；苷類組 PFK 顯著下調（P＜0.05）。

3.1.2 黃芩拆分組分對丙酮酸氧化成乙酰輔酶A階段相關酶表達情況的影響 見表2。實驗結果所示，與空白組比較，全成分組大鼠Ac-CoA表達顯著升高、PDH表達顯著性下降且具有統(tǒng)計學差異（P＜0.05）；苷類組 PDH 顯著下調（P＜0.05）。

表1 黃芩拆分組分對大鼠GCK、PFK、PK表達的影響（±s）ng/mL

表1 黃芩拆分組分對大鼠GCK、PFK、PK表達的影響（±s）ng/mL

注:與空白組比較，*P＜0.05。

組別 n GCK PFK空白組 10 3.33±0.45 3.49±0.57全成分組 10 2.89±0.25* 2.77±0.68*苷元組 10 3.16±0.23 3.17±0.28*苷類組 10 3.03±0.41* 3.47±0.69多糖組 10 3.21±0.59 3.89±0.44

表2 黃芩拆分組分對大鼠Ac-CoA、PDH蛋白影響（±s）ng/mL

表2 黃芩拆分組分對大鼠Ac-CoA、PDH蛋白影響（±s）ng/mL

注:與空白組比較，*P＜0.05。

組別 n AC-COA PDH空白組 10 9.69±1.59 13.40±2.20全成分組 10 12.32±2.49* 11.66±3.33*苷元組 10 10.46±1.36 14.81±3.51苷類組 10 10.42±1.65 10.01±2.88*多糖組 10 10.95±0.96 13.27±1.99

3.1.3 黃芩拆分組分對三羧酸循環(huán)過程相關酶表達情況的影響 見表3。結果可以得出，與空白組比較，全成分組CS、ICD蛋白表達下調，且具有統(tǒng)計學差異（P＜0.05）；苷元組 CS蛋白表達下調明顯（P＜0.05）。

表3 黃芩拆分組分對大鼠CS、ICD蛋白的影響（±s） ng/mL

表3 黃芩拆分組分對大鼠CS、ICD蛋白的影響（±s） ng/mL

注:與空白組比較，*P＜0.05。

ng/mL組別 n CS ICD空白組 10 7.13±1.67 12.84±2.19全成分組 10 5.70±0.72* 10.76±1.07*苷元組 10 6.55±0.68* 12.24±1.51苷類組 10 6.73±1.19 12.63±1.27多糖組 10 7.75±1.01 14.77±2.09影響（±s）

3.2 黃芩拆分組分對能量代謝過程中相關酶表達的影響 見表4。實驗結果所示，與空白組比較，全成分組可顯著性的降低ADK、CCR、NA-K-ATP酶（肝臟）的表達，具有統(tǒng)計學差異（P＜0.01）；苷元組可明顯降低COX、NA-K-ATP酶（肝臟）的表達且具有統(tǒng)計學差異（P＜0.05），其余指標均有回調趨勢；苷類組顯著性降低COX蛋白表達及NA-K-ATP（肌肉）活性（P＜0.05），其余指標均有回調作用；多糖組 ATP顯著降低（P＜0.05）。

3.3 黃芩拆分組分對正常大鼠內(nèi)分泌系統(tǒng)相關酶表達的影響 見表5。實驗結果所示，與空白組比較，全成分組和苷元組 T4 明顯降低（P＜0.05）；苷類組 T3、T4 水平降低且具有明顯差異（P＜0.05）。

表4 黃芩拆分組分對大鼠ADK、ATP、CCR、COX、NA-K-ATP的影響（±s）

表4 黃芩拆分組分對大鼠ADK、ATP、CCR、COX、NA-K-ATP的影響（±s）

注:與空白組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

組別 n ADK（ng/mL） ATP（ng/mL） CCR（ng/mL） COX（ng/mL） NA+-K+-ATP（U/mg）（肝臟） NA+-K+-ATP（U/mg）（肌肉）空白組 10 4.54±0.33 3.26±0.50 0.69±0.20 1.23±0.19 2.16±0.40 2.62±0.48全成分組 10 4.20±3.75* 3.75±0.47 0.51±0.13* 1.12±0.15 1.50±0.46** 2.35±0.90苷元組 10 4.68±3.23 3.23±0.39 0.67±0.19 1.05±0.12* 1.61±0.77* 2.40±0.87苷類組 10 4.38±3.30 3.20±0.36 0.60±0.18 1.03±0.16* 1.76±0.72 2.13±0.39*多糖組 10 4.43±2.77 2.77±0.29* 0.64±0.18 1.09±0.13 2.71±0.51 2.65±0.69

表5 黃芩拆分組分對大鼠T3、T4的影響（±s）ng/mL

表5 黃芩拆分組分對大鼠T3、T4的影響（±s）ng/mL

注:與空白組比較，*P＜0.05。

組別 n T3 T4空白組 10 0.99±0.12 23.56±3.98全成分組 10 0.97±0.11 19.77±4.37*苷元組 10 0.95±0.39 21.79±3.85*苷類組 10 0.85±0.13* 19.14±4.01*多糖組 10 1.03±0.12 21.37±4.68

3.4 黃芩拆分組分對正常大鼠植物神經(jīng)系統(tǒng)相關酶表達的影響 見表6。實驗結果所示，與空白組比較，全成分組大鼠 5-HT 水平顯著上升（P＞0.05）；苷元組大鼠5-HT水平明顯升高、AchE水平顯著降低（P＜0.05），NE 有降低趨勢但不明顯；苷類組 5-HT 水平明顯升高、NE水平明顯下降，AchE有降低趨勢；多糖組5-HT升高，AchE和NE下降，但均不顯。

表6 黃芩拆分組分對大鼠5-HT、AchE、NE的影響（±s）

表6 黃芩拆分組分對大鼠5-HT、AchE、NE的影響（±s）

注:與空白組比較，*P＜0.05。

組別 n 5-HT（U/mL） AchE（ng/mL） NE（nmol/mL）空白組 10 7.38±1.91 33.17±2.26 7.79±0.78全成分組 10 10.59±2.74* 31.53±4.45 7.78±0.93苷元組 10 12.42±3.35* 30.70±2.14* 8.19±0.62苷類組 10 7.21±1.94 32.72±2.04 7.16±1.00多糖組 10 8.24±1.98 31.57±2.26 8.31±0.93

4 討論

王伽伯等[6]提出中藥藥性物質基礎研究，研究藥性相同或相近的中藥中的一類化學成分是揭示藥性實質的有效途徑，發(fā)現(xiàn)寒性藥抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)的興奮性、減弱循環(huán)系統(tǒng)、降低機體產(chǎn)熱量。王艷艷等[7]發(fā)現(xiàn)具有寒涼藥性的中藥抑制線粒體的能量代謝；溫熱藥與之相反。黃麗萍等[8-9]提出寒性中藥黃芩抑制能量代謝，抑制NA-K-ATP酶的生成。戴璐[10]通過觀察寒性中藥黃連和大黃對實熱證大鼠物質代謝、能量代謝及甲狀腺軸功能的影響，發(fā)現(xiàn)寒涼中藥抑制物質代謝、能量代謝及甲狀腺軸功能。滕佳林等[11]也發(fā)現(xiàn)寒性藥使腦內(nèi)5-HT增加，NE減少。黃俊山等[12]發(fā)現(xiàn)寒涼藥抑制甲狀腺激素。克迎迎等[13]發(fā)現(xiàn)桑白皮拆分組分抑制物質能量代謝，推測其藥性可能為寒涼。SONG等[14]發(fā)現(xiàn)蒼術能夠通過線粒體中的C2C12肌管促進糖代謝和脂肪代謝。在前期的實驗研究基礎上，本實驗考察物質代謝、能量代謝、內(nèi)分泌系統(tǒng)以及植物神經(jīng)系統(tǒng)相關指標的表達，以探討黃芩拆分組分的藥性歸屬。

總體來說黃芩全成分抑制物質代謝；苷元和苷類具有與寒涼中藥相同的作用趨勢，推測其抑制物質代謝；在物質代謝階段多糖的作用趨勢不明顯[15]。

在能量代謝的過程中，黃芩全成分顯著降低ADK、CCR、COX、NA-K-ATP酶的表達；對 ATP的影響不明顯，主要可能是三羧酸循環(huán)過程被抑制，而該過程是主要生成ATP的過程，糖原的合成和分解均處于動態(tài)過程提供能量，脂肪分解提供能量以保持機體的正常功能。由以上指標可以推斷出黃芩全成分對正常大鼠的能量代謝具有抑制作用；通過部分指標的表達，推測苷元和苷類具有與寒涼中藥相同的作用趨勢，推測其抑制能量代謝；在該過程中多糖抑制ATP的生成，推測多糖抑制能量代謝過程。

黃芩全成分和苷元抑制植物神經(jīng)系統(tǒng)，苷類有抑制傾向，NE和AchE降低，5-HT升高，表現(xiàn)出與寒涼中藥相似的作用趨勢，由此可以推斷出其黃芩全成分和苷元藥性為寒性，該階段苷類組分和多糖組分的趨勢不明顯，需要進一步證實。

陳慧等[17]提出中藥寒熱平性質與化學成分的類別及含量有相關性，在寒性中藥中黃酮類化合物出現(xiàn)的頻率以及含量明顯高于其他化合物，在熱性中藥中萜類和揮發(fā)油出現(xiàn)的頻率以及含量最高，在平性中藥中黃酮類化合物出現(xiàn)的頻率和糖類、萜類和揮發(fā)油相差不大，平性中藥無寒熱之偏，糖類在寒熱平3種中藥中出現(xiàn)的頻率相差不大。綜合上述實驗結果，根據(jù)黃芩拆分組分對物質代謝、能量代謝、內(nèi)分泌系統(tǒng)及植物神經(jīng)系統(tǒng)相關指標表達的影響，推斷出苷元和苷類的藥性為寒，是黃芩藥性為寒的主要物質基礎，多糖的藥性可能為微寒，尚需進一步的實驗來進行驗證。

[1]彭 成.中藥藥理學[M].北京:中國中醫(yī)藥出版社,2012.

[2]李學林，高曉潔.試論中藥藥性理論的整體性[J].中華中醫(yī)藥雜志,2016,31(6):2038-2041.

[3]匡海學，王艷宏.基于中藥性味可拆分性和可組合性的中藥性味理論研究新模式[J].世界科學技術:中醫(yī)現(xiàn)代化，2011,13(1):25-29.

[4]歐陽兵,王振國.中藥四性“性-效-物質三元論”假說及其論證[J].山東中醫(yī)藥大學學報.2008,32(3).

[5]國家藥典委員會.中國藥典[M].北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2015:301.

[6]王伽伯,金 城,肖小河,等.中藥藥性研究回顧與思考[J].中華中醫(yī)藥雜志，2008,23(7):572-576.

[7]王艷艷，孫 雪.中藥寒熱藥性與線粒體能量代謝關系研究[J].中醫(yī)藥信息，2013,30（4）:48-50.

[8]黃麗萍，周 蓉.寒性中藥黃芩對大樹能量代謝的影響[J].中藥材，2010,33（4）:575-577.

[9]黃麗萍，彭淑紅.6味寒性中藥對大鼠肝臟能量代謝的影響[J].中國中藥雜志，2009,34（24）:3255-325.

[10]戴 璐.寒性中藥對實熱證療效的表述及大黃、黃連對實熱證大鼠效應的實驗研究[D].濟南:山東中醫(yī)藥大學，2011.

[11]滕佳林，張 斌.黃連、梔子、附子、干姜對正常大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)的影響[C].北京:第3屆臨床中藥學學術研討會論文集，2010.

[12]黃俊山，黃國良.從血中檢測 FT3、FT4、T、E2 及皮質醇等指標探討寒熱證的本質[J].中國中西醫(yī)結合雜志，2002,22（2）:113-115.

[13]克迎迎，袁培培.桑白皮化學拆分組分對正常大鼠物質代謝與能量代謝的影響[J].世界中醫(yī)藥，2015,10（12）:1847-1853.

[14]Song MY,Kang SY,Oh TW,et al.The roots of Atractylodes macrocephala koidzumienhanced glucose and lipid metabolisminC2C12myotubesviamitochondrialregulation[J].Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine,2015,11（4）:108-112.

[15]Nabuurs CI，Choe CU，Veltien A，et al.Disturbed energy metabolism and muscular dystrophycaused by pure creatine deficiency are reversibleby creatine intake[J].The Journal of Physiology，2013:571-592.

[16]李振宇,王秋紅.基于對植物神經(jīng)系統(tǒng)相關指標影響的洋金花各化學拆分組分的藥性研究[J].中國實驗方劑學雜志，2016,22（9）:86-90.

[17]陳 慧，孫 慧，楊秀艷,等.中藥寒熱平性質與其化學成分類別相關性研究[J].遼寧中醫(yī)藥大學學報，2016,18（7）:102-105.