當歸補血湯對糖尿病腎病大鼠PERK通路的影響*

沈 鑫，張思泉，張瑩雯，柯浩亮，帥 瑜

（武漢大學附屬中南醫院，武漢 430071）

糖尿病腎病（DN）是糖尿病的一種嚴重并發癥，是導致終末腎衰竭（ESRD）的主要原因之一[1]。近30年來，隨著世界范圍內糖尿病患者的增加，DN發病率也隨之急劇提高[2]。DN發病機制復雜，涉及多種細胞因子和信號轉導通路，包括糖代謝紊亂、氧化應激、血流動力學異常、細胞因子參與以及遺傳因素等[3]。內質網應激（ERS）是近年來新發現的DN發病機制，被證實與DN關系密切[4-6]。本實驗旨在探討當歸補血湯對DN大鼠GRP78-PERK-eIF2α通路的影響，為當歸補血湯治療DN提供新依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 SPF級雄性SD大鼠60只，6～8周齡，體質量180～210 g，均購自武漢大學實驗動物中心[許可證號:SCXK（鄂）2014-0004]。飼養于武漢大學實驗動物中心標準飼養房，室溫（22±2）℃，相對濕度60%，每日光照12 h，實驗期間不限飲食和飲水，定期更換敷料，連續觀察8周。

1.1.2 實驗藥物 當歸補血湯由當歸、黃芪按1∶1配比（前期實驗提示此為治療DN最優配比），藥物飲片購自湖北省中藥材公司，當歸、黃芪生藥飲片浸水1 h，煮沸40 min，過濾后的藥渣再次加水煮沸，重復2次，合并煎煮液，在水浴中濃縮，置4℃冰箱備用，按實驗需要再行旋轉蒸發濃縮備用。

1.1.3 主要儀器和試劑 超凈工作臺（蘇凈安泰），全自動生化分析儀（日本東芝公司），倒置光顯微鏡（Olympus日本），透射電子顯微鏡（日立公司），超薄切片機（瑞典Bromma公司），臺式離心機（上海安亭科學儀器廠），PCR儀（杭州博日科技），電泳儀（北京市六一儀器廠），鏈脲佐菌素（STZ，美國Sigma公司，溶于 0.1 mol/L，pH＝4.3 的檸檬酸鈉緩沖液中）；RIPA總蛋白裂解液、SDS-PAGE凝膠制備試劑盒、BCA蛋白質濃度測定試劑盒、ECL化學發光檢測試劑盒（ASPEN）等。

1.2 方法

1.2.1 飼養條件 實驗動物飼養于武漢大學實驗動物中心標準飼養房，普通飼料和高脂飼料均由實驗動物中心提供。室溫20℃，相對濕度60%，每日光照12 h，實驗前先適應性飼養1周，實驗期間不限飲食和飲水，定期更換敷料，連續觀察8周。

1.2.2 糖尿病大鼠的分組和造模 大鼠適應性飼養1周后，隨機選取10只為對照組（n＝10），喂普通飼料;其余大鼠為造模組（n＝50）喂以高脂飼料，大鼠均不限飲食和飲水。1周后，將造模組大鼠禁食12h，并給予一次性腹腔注射STZ 30 mg/kg（溶于0.1 mmol/L，pH＝4.3的檸檬酸鈉緩沖液中），對照組給予相同劑量的檸檬酸鈉緩沖液（0.1 mmol/L，pH＝4.3）一次性腹腔注射，注射48 h后采足底靜脈血，連續3 d測隨機血糖，血糖≥16.7 μmol/L 視為糖尿病大鼠造模成功[7]。造模組成活且造模成功的大鼠共43只，隨機選取40只納入實驗，隨機分為模型組[n＝10，生理鹽水10 mL/（kg·d）]，當歸補血湯高劑量組[高劑量組，n＝10，7.14 g/（kg·d）當歸補血湯溶縮液]，當歸補血湯低劑量組[低劑量組，n＝10，1.79 g/（kg·d）當歸補血湯溶縮液]，格列齊特組[n＝10，2.68 mg/（kg·d）格列齊特緩釋片]，以上藥物均通過灌胃方式給藥，對照組（N組）給予生理鹽水10 mL/（kg·d）灌胃給藥，連續灌胃8周后取材。

1.2.3 一般情況及生化指標的檢測 觀察大鼠的精神、毛色、活動是否靈活、食量、飲水量、尿量等；實驗第8周末，用代謝籠收集24 h尿液，記錄尿量并于-80℃冰箱保存；所有大鼠禁食12 h，禁水8 h后，稱量大鼠體質量，無菌條件下腹腔注射戊巴比妥（50 mg/kg）麻醉大鼠，腹主動脈采血，離心后取血清，全自動生化分析儀測大鼠空腹血糖（GLU）、甘油三酯（TG）、總膽固醇（TC）、肌酐（Scr）、尿素氮（BUN）；無菌條件下摘取雙腎。

1.2.4 光鏡及電鏡下觀察腎組織 取小鼠腎組織用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，切片，將組織切片按常規方法進行過碘酸雪夫氏染色（PAS）染色，于光鏡200倍視野下觀察腎臟組織結構變化。另取腎皮質剪碎用1.25%戊二醛固定，用透射電鏡觀察腎臟超微結構。

1.2.5 免疫組化檢測GRP78、PERK、eIF2α蛋白的表達 取小鼠腎組織于4%多聚甲醛溶液固定、石蠟包埋，將石蠟切片脫蠟至水后用EDTA緩沖液中微波修復，置于3%過氧化氫溶液中孵育，甩干后以5%BSA封閉，依次加入稀釋的一抗、相應種屬的二抗于保濕盒中孵育，滴加配制DAB，顯微鏡控制顯色，中性樹膠封固后用顯微鏡觀察拍照。

1.2.6 PCR檢測大鼠腎組織中GRP78 mRNA、PERK mRNA、eIF2α mRNA的表達 大鼠 GRP78、PERK、eIF2α 引 物 由 Invitrogen Biotechnology Co.,LTD.中國公司合成；總RNA的提取按試劑盒說明操作，用紫外分光光度計測量OD值并計算RNA濃度和質量；根據RNA的量，建立一個20 μL的反應體系，在RT-PCR儀器中進行逆轉錄反應:42℃30 min，80℃ 5 min，4℃冷卻，-20℃保存，在 PCR儀上擴增；目的基因擴增用ΔΔCT法計算，A＝CT（目的基因，實驗樣本）-CT(內標基因，實驗樣本)，B＝CT（目的基因，對照樣本）-CT（內標基因，對照樣本），K＝A-B，表達倍數＝2-K，采用 β-actin為內參，計算GRP78、PERK、eIF2α 的 CT值。

1.2.7 Western blot法檢測 GRP78、PERK、eIF2α 蛋白的表達 每組隨機選取兩只大鼠的腎組織進行蛋白提取，檢測蛋白濃度，保證每個樣品總蛋白量。每個樣品總蛋白上樣量均為40 μg，進行制膠與上樣，按濃縮膠80 V、分離膠120 V進行恒壓電泳，按300 mA恒流轉膜，轉膜時間根據目的蛋白分子量大小調整，將轉好的膜加入封閉液室溫封閉1 h，加入已稀釋好的一抗4℃過夜（兔屬GAPDH，GRP78與5%脫脂牛奶呈 1∶2 000，PERK 與 5%BSA 呈 1∶1 000，eIF2α 與 5%BSA 呈 1∶2 000）用 TBST 洗 3次，每次5 min，加入稀釋好的二抗（HRP-Goat anti Rabbit與5%脫脂牛奶呈 1∶10 000），室溫孵育 30 min，用TBST在室溫搖床上洗4次，每次5 min，暗室中曝光，將膠片進行掃描存檔，AlphaEaseFC 4.0軟件處理系統分析目標帶的光密度值。

1.2.8 統計學方法 采用SPSS 20.0統計分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示，組間用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 一般情況 對照組大鼠體毛光澤，活動敏捷，飲食量、尿量無明顯變化，實驗第8周末，體質量均較前增加；大鼠造模成功率為86%（43/50），造模成功后的大鼠體質量較對照組明顯減輕，每日飲水量及尿量均多于對照組；造模后第4天可見大鼠皮毛濕黃，活動遲緩，多飲、多食、多尿、體質量下降，至實驗第8周末，模型組大鼠上述癥狀最明顯，治療組上述情況得到不同程度改善，以高劑量組改善最為明顯。

2.2 生化指標的檢測 與對照組相比，模型組大鼠血糖（GLU）、血脂（TG、TC）、尿素氮（BUN）、肌酐（Scr）及蛋白尿（MAU）均明顯升高（P＜0.01）；與模型組相比，各治療組的 GLU、TG、TC、BUN、Scr及 MAU均下降（P＜0.01 或 P＜0.05），3 個治療組中，格列齊特組的GLU下降最顯著（P＜0.01），高劑量組BUN、Scr、MAU下降最明顯（P＜0.01），腎功能改善明顯。見表 1、表 2。

表1 各組大鼠GLU、血脂的檢測（±s）mmol/L

表1 各組大鼠GLU、血脂的檢測（±s）mmol/L

注:與對照組比較，##P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與格列齊特組比較，△△P＜0.01。

組別 n GLU TG TC對照組 10 5.07±0.61 1.13±0.10 0.83±0.10模型組 10 27.41±0.96## 4.14±0.12## 2.14±0.10##格列齊特組 10 9.92±0.52##** 2.26±0.11##** 1.27±0.10##**低劑量組 10 15.71±0.60##**△△ 3.91±0.18##**△△ 2.05±0.07##*△△高劑量組 10 11.72±0.69##**△△ 2.40±0.15##** 1.35±0.08##**

表2 各組大鼠BUN、Scr及MAU的檢測（±s）

表2 各組大鼠BUN、Scr及MAU的檢測（±s）

注:與對照組比較，##P＜0.01；與模型組比較，**P＜0.01；與格列齊特組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。

組別nBUN（mmol/L）Scr（μmol/L）MAU（mg/L）對照組 10 11.48±0.60 5.12±0.60 0.76±0.05模型組 10 27.81±0.49## 13.98±0.77## 1.50±0.03##格列齊特組 10 18.77±0.45##** 6.41±0.64##** 1.31±0.03##**低劑量組 10 19.45±0.78##**△ 8.27±0.57##**△△ 1.26±0.03##**△高劑量組 10 16.09±0.62##**△△ 5.56±0.48#**△△ 1.02±0.04##**△△

2.3 光鏡及電鏡下腎臟形態結構觀察

2.3.1 光鏡下腎臟形態結構 對照組大鼠腎組織結構完整。模型組大鼠腎組織嚴重損傷，可見系膜細胞增生、基質增多，腎小球基底膜（GBM）增厚，PAS染色呈強陽性，部分腎小球可見毛細血管間出現PAS染色陽性的層狀結節及節段性透明樣變性，提示腎小球硬化，腎小管上皮腫脹，腎小管管腔變窄。格列齊特組和低劑量組可見輕度彌漫性系膜區細胞增生伴GBM增厚，腎小管無明顯改變。高劑量組腎結構改善明顯，僅見腎小球輕度水腫，無增生性病變，腎小管無明顯改變。見圖1。

2.3.2 電鏡下腎臟形態結構 對照組GBM厚度基本均勻適中，足細胞位于GBM外層，足突結構完整，呈柵欄狀整齊排列。模型組GBM增厚，足細胞出現空泡改變，裂隙膜減少，足突融合，部分足細胞從GBM脫落，排列紊亂；腎小管上皮細胞腫脹變性，可見內質網、線粒體和細胞核腫脹。格列齊特組和低劑量組病變減輕，GBM輕度增厚，系膜基質輕度增多。高劑量組病變改善明顯。見圖2。

2.4 各組 GRP78、PERK、eIF2α的免疫組化結果 GRP78、PERK、eIF2α在對照組中有少量表達，表現為棕黃色顆粒，三者主要定位在腎小管上皮細胞胞漿內;模型組的 GRP78、PERK、eIF2α 表達較對照組明顯增多，差異具有統計學意義（P＜0.01），三者主要定位于腎小管；高劑量組、低劑量組與格列齊特組的GRP78、PERK、eIF2α表達均明顯低于模型組（P＜0.01），高劑量組相比于格列齊特組表達更低（P＜0.01 或 P＜0.05）。見表 3 及圖 3-5。

表3 各組GRP78、PERK、eIF2α的蛋白表達情況（±s）

表3 各組GRP78、PERK、eIF2α的蛋白表達情況（±s）

注:與對照組比較，##P＜0.01；與模型組比較，**P＜0.01;與格列齊特組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。

組別 n GRP78 PERK eIF2α對照組 10 3 989.66± 259.44 1 834.63± 116.73 1 683.58± 78.94模型組 10 19 703.39±1 524.04## 12 787.18±1 883.59## 20 566.95±1 944.09##格列齊特組 10 7 238.58± 487.35##** 5 793.39± 401.51##** 5 605.04± 465.45##**低劑量組 10 10 820.29±1 105.42##**△△ 7 738.69± 634.03##**△ 11 707.93±1 340.87##**△△高劑量組 10 5 284.77± 313.01**△ 3 383.93± 249.95**△ 2 250.02± 58.41**△△

2.5 各組GRP78、PERK、eIF2α的mRNA表達情況GRP78、PERK、eIF2α在正常腎組織中有一定量的表達，相比于對照組，模型組大鼠GRP78、PERK、eIF2α 的表達顯著增高，差異具有統計學意義（P＜0.01）。相比于模型組，3個治療組的 GRP78、PERK、eIF2α的表達均降低，差異具有統計學意義（P＜0.01）。相比于格列齊特組，高劑量組的GRP78、PERK、eIF2α的表達更低（P＜0.01 或 P＜0.05）。見表 4。

2.6 Western blot測 GRP78、PERK、eIF2α 的蛋白表達 相比于對照組，模型組大鼠GRP78、PERK、eIF2α的蛋白表達顯著增高，差異具有統計學意義（P＜0.01）；相比于模型組，各治療組的GRP78、PERK、eIF2α的表達均降低，差異具有統計學意義（P＜0.01）；相比于格列齊特組，高劑量組的GRP78、PERK、eIF2α的表達更低（P＜0.01 或 P＜0.05），見表 5 及圖 6。

3 討論

圖1 各組大鼠腎組織PAS染色結果（×200）

圖2 各組大鼠腎組織電鏡下觀察結果(×2 000)

圖3 免疫組化檢測GRP78蛋白表達結果(×200)

圖4 免疫組化檢測PERK蛋白表達結果(×200)

DN在中醫學歸為消渴病下消，基本病機為“氣血兩虛兼血瘀”。當歸補血湯中黃芪味甘溫，可益氣固表，補氣升陽；當歸味甘辛溫，可補血生血行血，兩者配伍則陽生陰長，氣旺血生，具有補氣活血之功效，與其病機契合。現代研究發現，黃芪甲苷（IV）可通過下調PERK-ATF4-CHOP通路發揮抑制足細胞凋亡，保護腎組織，防治DN的作用[8]。且當歸與黃芪配伍，當歸可增強黃芪中黃芪甲苷在體內的活力，并可使黃芪甲苷達峰時間提前1倍[tmax由（4.00±1.54）h 至（2.00±0.95）h]，達峰濃度提高 1 倍[Cmax由（60±7）μg/L 到（146±27）μg/L]，加速黃芪甲苷發揮功效的進程[9]。當歸補血湯可抑制高糖條件下腎小球細胞膜外基質蛋白表達[10]，下調多個靶器官相關蛋白因子（BMP-7、TGF、HPA 等），具有預防和治療早期DN的作用[11-13]。

圖5 免疫組化檢測eIF2α蛋白表達結果(×200)

表 4 各組 GRP78、PERK、eIF2α 的 mRNA 表達（±s）

表 4 各組 GRP78、PERK、eIF2α 的 mRNA 表達（±s）

注:與對照組比較，##P＜0.01；與模型組比較，**P＜0.01；與格列齊特組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。

組別 n GRP78 PERK eIF2α對照組 10 0.96±0.05 0.97±0.09 0.97±0.10模型組 10 4.50±0.13## 3.11±0.08## 3.02±0.24##格列齊特組 10 1.82±0.12##** 1.80±0.10##** 1.72±0.04##**低劑量組 10 3.05±0.08##**△△ 2.32±0.10##**△△ 2.39±0.07##**△△高劑量組 10 1.49±0.04##**△△ 1.48±0.04##**△△ 1.40±0.04##**△

表 5 各組 GRP78、PERK、eIF2α 的蛋白表達（±s）

表 5 各組 GRP78、PERK、eIF2α 的蛋白表達（±s）

注:與對照組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與模型組比較，**P＜0.01；與格列齊特組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。

組別 n GRP78 PERK eIF2α對照組 10 0.07±0.01 0.04±0.02 0.04±0.01模型組 10 0.84±0.10## 0.47±0.05## 0.66±0.07##格列齊特組 10 0.32±0.05##** 0.20±0.03##** 0.26±0.03##**低劑量組 10 0.51±0.02##**△△ 0.32±0.06##**△△ 0.38±0.01##**△△高劑量組 10 0.18±0.02#**△△ 0.12±0.03#**△ 0.12±0.01#**△△

圖6 Western-blot電泳條帶圖

本實驗中，當歸補血湯和格列齊特均可改善DN大鼠的一般情況，降低血糖、血脂，而且在降低尿蛋白，改善腎功能和腎臟結構損害方面，當歸補血湯優于格列齊特。免疫組化、Western Blot及PCR顯示模型組大鼠GRP78、PERK、eIF2α的表達明顯高于對照組，表明ERS已經激活；當歸補血湯治療組大鼠腎組織中GRP78、PERK、eIF2α的表達相比于模型組明顯下降，高劑量組下降更明顯。實驗表明當歸補血湯可抑制PERK通路相關蛋白，緩解ERS，具有保護腎組織結構和腎功能作用，且呈濃度依賴性。

實驗結果為臨床治療DN提供了新的依據。但仍存在問題需進一步探究，當歸補血湯具體作用于PERK通路的機制尚不明確，推測當歸補血湯可通過抑制PERK通路進一步抑制eIF2α下游的ATF4、CHOP、Capase12等凋亡相關基因緩解ERS造成的損害，是否激活了下游其他分子通路，還需更深入的研究。

[1]Packham DK,Alves TP,Dwyer JP,et al.Relative incidence of ESRD versus cardiovascular mortality in proteinuric type 2 diabetes and nephropathy:results from the DIAMETRIC(Diabetes Mellitus Treatment for Renal Insufficiency Con-sortium)database[J].Am J Kidney Dis,2012,59(1):75-83.

[2]Finucane MM,Stevens GA,Cowan MJ,et al.National,regional,and global trends in body-mass index since 1980:systematic analysis of health examination surveys and epidemiological studies with 960 country-years and 9.1 million participants[J].Lancet,2011,377(9765):557-567.

[3]李敏州,高彥彬,馬鳴飛,等.糖尿病腎病發病機制研究進展[J].中國實驗方劑學雜志,2012,18(22):344-349.

[4]Qi W,Mu J,Luo ZF,et al.Attenuation of diabetic nephropathy in diabetes rats induced by streptozotocin by regulating the endoplasmic reticulum stress inflammatory response[J].Metabolism,2011,60(5):594-603.

[5]Taniguchi M,Yoshida H.Endoplasmic reticulum stress in kidney function and disease[J].Curr Opin Nephrol Hypertens,2015,24(4):345-350.

[6]Ma JH,Wang JJ,Zhang SX.The unfolded protein response and diabetic retinopathy[J].J Diabetes Res,2014:160140-160153.

[7]李玉山,劉麗秋.實驗性2型糖尿病腎病大鼠模型研究[J].中國實驗診斷學,2009,13(5):574-577.

[8]Chen Y,Gui D,Chen J,et al.Down-regulation of PERKATF4-CHOP pathway by Astragaloside IV is associated with the inhibition of endoplasmic reticulum stress-induced podocyte apoptosis in diabetic rats[J].Cell Physiol Biochem,2014,33(6):1975-1987.

[9]王文萍,曹琦琛,王華偉,等.當歸補血湯不同配伍的藥動學研究[J].中國臨床藥理學與治療學,2009,14(6):659-663.

[10]Ke HL,Zhang YW,Zhou BF,et al.Effects of Danggui Buxue Tang,a traditional Chinese herbal decoction,on high glucose-induced proliferation and expression of extracellular matrix proteins in glomerular mesangial cells[J].Nat Prod Res,2012,26(11):1022-1026.

[11]任小旦,張瑩雯.黃芪、當歸及其復方治療糖尿病腎病的研究進展[J].中華中醫藥學刊,2015,33(10):2318-2320.

[12]Fan Y,Lee K,Wang N,et al.The Role of endoplasmic reticulum stress in diabetic nephropathy[J].Curr Diab Rep,2017,17(3):17-23.

[13]Cunard R,Sharma K.The endoplasmic reticulum stress response and diabetic kidney disease[J].Am J Physiol Renal Physiol,2011,300(5):F1054-F1061.