中藥渣堆肥過程中氮素轉化及相關微生物菌群變化的研究

魯耀雄 ，高鵬，崔新衛，盧紅玲，陳冬祥，龍世平，彭福元*

（1. 湖南省農業科學院農業環境生態研究所，湖南 長沙 410125；2. 湖南農業大學植物保護學院，湖南 長沙 410125；3. 湖南百威生物科技有限公司，湖南 瀏陽 410318）

隨著我國中醫藥事業的發展，中草藥加工過程中產生的中藥渣日益增加，年排放量達3 000萬t[1-2]。中藥渣一般是濕物料，受運輸和無法就地消納等原因的影響，處理辦法是焚燒、填埋和露天堆放等方式，主要以堆放為主，長期堆放極易腐壞，其異味臭，在夏季更為嚴重，堆放點周圍臭氣熏天、蚊蠅遍地、污水橫流，對環境造成極大污染，同時造成了資源浪費，因此，中藥渣廢棄物的資源化、無害化和減量化利用對中藥企業和環境保護意義重大。

有機固體廢棄物的處理和有效利用是當前環保研究的熱點之一[3-5]，面對中草藥加工的大規模發展而產生的中藥渣廢棄物日益增多，如何合理有效地處理中藥渣成為中藥企業所要面臨的嚴峻問題[6]。高溫好氧堆肥是目前最常用的一種有機固體廢棄物處理方法[7-8]，可以實現中藥渣等有機廢棄物的無害化、減量化和資源化利用[9]。高溫好氧堆肥是通過微生物將有機固體廢棄物快速分解和轉變成穩定的腐殖酸[10]來完成的。目前，有關高溫好氧堆肥的微生物方面研究主要集中在添加不同微生物菌劑對堆肥效果的影響[11-13]，而有關高溫好氧堆肥過程中的氮素轉化與氮素轉化相關微生物的關系研究較少。

堆肥過程中氮素形態的轉化及其含量直接關系到堆肥產品的農業利用價值[14]。研究堆肥過程的微生物數量變化，特別是氮素轉化相關微生物數量變化，可以了解氮素形態在堆肥過程中的變化，從而通過控制堆肥條件來實現堆肥的氮素形態轉化，主要是調控銨態氮向硝態氮轉化，減少堆肥過程中的氮損失[12,15-16]。因此，了解和掌握在中藥渣堆肥過程中氮素轉化相關微生物數量變化關系，可以有目的地調控相關微生物的數量和活性，減少氮素損失，縮短堆肥時間[17]，提高堆肥制品質量[18]。

本試驗通過利用以中藥渣為堆肥的主要原料，結合其周邊的蘆葦渣、醬油渣等有機固體廢棄物進行配比，在碳氮比基本相同的條件下，添加有機物料腐熟菌劑，研究其堆肥過程中的溫度、微生物總量、氮素相關微生物數量、全氮、銨態氮、硝態氮和發芽指數等堆肥進程與腐熟情況的指標參數，為合理有效利用中藥渣等有機固體廢棄物，減少環境污染、發展可持續經濟和循環農業提供技術參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

堆肥原料包括中藥渣（由枳殼、檳榔、烏藥和木香等混合水提取四磨湯后的藥渣）、蘆葦渣和醬油渣。中藥渣來源于益陽市漢森藥業，蘆葦渣來源于益陽市沅江市紙廠，醬油渣來源于長沙市寧鄉市加加醬油廠，含水量較大的原料經過適當晾干后使用。堆肥材料的主要性質見表1。

試驗應用的菌劑為市場購買的有機物料腐熟菌劑，用于秸稈、禽畜糞便、雜草和城市生活垃圾等有機物料堆肥，含有芽孢桿菌、放線菌、酵母菌和絲狀真菌等有益微生物及其各種胞外酶類，菌種吸附載體為有機質，有效活菌數≥2.0×1010CFU/g。

表1 堆肥材料理化性狀Table 1 Physical and chemica1 properties of composting materials

1.2 試驗設計

試驗根據不同廢渣比例配比設置4個處理。處理一（T1）： 75%中藥渣+25%醬油渣（原料按干基重量配比，下同）；處理二（T2）： 60%中藥渣+15%蘆葦渣+25%醬油渣；處理三（T3）：45%中藥渣+30%蘆葦渣+25%醬油渣；處理四（T4）：30%中藥渣+45%蘆葦渣+25%醬油渣。每個處理原料干重為1.5 t，有機物料腐熟菌劑的添加量為500 g/t。先將有機物料腐熟菌劑稱好放入水桶，加蘆葦渣做預混料攪拌均勻，然后均勻散在有機物料上，并控制物料含水量為60%～65%（用手捏成團并有水滴滲出但不滴下，松手掉下即散開為宜）。將每堆物料堆成1.2 m高的圓錐形堆體進行發酵，采用鏟車和人工配合翻堆，分別在堆肥的7、14、21和28 d早上9:30進行翻堆，堆肥全過程時間為35 d。

試驗于2016年7—8月在瀏陽市湖南百威生物科技有限公司進行。

1.3 測定項目和方法

取樣方法：每7 d取樣一次，在各處理的堆體上任意選取3點位置，取其體表面深30 cm處的樣品共計1 kg左右，混合均勻，然后平均分成兩份，一份鮮樣用于測定試驗不同時期的微生物（細菌、放線菌和真菌）、氮素轉化微生物生理類群（自生固氮菌、氨化細菌、硝化細菌和反硝化細菌）的數量；一份鮮樣經風干后，粉碎過篩，用于統一測定試驗不同時期的銨態氮、硝態氮、全氮和種子發芽指數（GI），以及堆肥前后的全磷、全鉀和有機質。

溫度測定：在每天上午8:30，分別在堆體3個部位用60 cm長的溫度計插入堆體30 cm深處，待溫度計讀數穩定后計數，取同期3個不同部位溫度平均值為該處理當天的堆體溫度。同時測定上午8:30的室內溫度為當天的室內溫度。

堆肥細菌、放線菌和真菌的數量測定方法：采用平板稀釋培養計數法[19]。

自生固氮菌、氨化細菌、硝化細菌、反硝化細菌的測定方法：采用稀釋培養計數法（MPN法）[20]。銨態氮、硝態氮測定采用農業部的肥料硝態氮、銨態氮、酰胺態氮含量的測定行業標準（NY/T 1116—2014），全氮、P2O5、K2O和有機質測定采用農業部的有機肥料行業標準（NY 525—2012）的方法。

1.4 種子發芽指數試驗

稱取試驗不同堆肥時期的風干樣品25 g于500 mL的三角瓶中，加入250 mL去離子水，150 rpm振蕩30 min，過濾后，吸取濾液20 mL，加入放有兩張濾紙的直徑為9 cm培養皿中，均勻放置20粒飽滿的蘿卜種子，再置入到25 ℃培養箱48 h后，測定種子發芽率和根長[21]。對照為去離子水。每個處理重復3次。

1.5 計算與統計分析

發芽指數計算方法為：

式中：GI、GT、LT、GCK和LCK分別代表種子發芽指數（%）、處理發芽率（%）、處理根長（cm）、對照發芽率（%）和對照根長（cm）。

試驗數據采用Excel 2003和SAS 8.1軟件進行統計分析，采用最小顯著差異法（1east signif i cant difference，LSD）進行多重比較。

2 結果與分析

2.1 堆肥過程中的溫度變化

不同處理的堆體溫度因翻堆而呈現小周期性變化，但是翻堆對堆體的整體溫度影響不大，同期堆體溫度高的T4翻堆后溫度高于其他處理（圖1）。T1、T2和T4在前4個周期（0～28 d），基本上都是在翻堆后堆體溫度逐漸上升，在第5個周期（28～35 d）時，翻堆后堆體溫度逐漸上升，然后再緩慢下降，而T3在前3個周期（0～21 d）都是在翻堆后堆體溫度逐漸上升，在后2個周期（21～35 d）都是在翻堆后堆體溫度逐漸上升然后再緩慢下降。整個堆肥過程中，除第1個周期開始升溫階段、翻堆后的第二天上午以及第5個周期降溫的后期，所有處理的堆體溫度基本上都高于55 ℃。

圖1 堆肥過程中溫度的變化Fig. 1 Change of temperature during composting

相比其他處理，堆肥初期（0～7 d)，T4的堆體升溫最快，在堆肥進行2 d時，堆體溫度達到了58.75 ℃，其次是T3和T2，而T1的堆體升溫最慢，在堆肥進行7 d上午時，堆體的溫度還只有54.25 ℃。T4在前3個周期時，堆體溫度明顯高于其他處理，且堆體溫度在高溫階段基本上都維持在69 ℃左右。T3在前4個周期時，前期升溫階段、中期高溫維持階段的堆體溫度都處在4個處理的中間位置，并且高溫維持階段的堆體溫度在62 ℃左右，而后期降溫比較迅速，特別是第5個周期時，溫度下降明顯快于其他三個處理。說明中藥渣不同處理的堆肥溫度趨勢變化不受環境溫度和翻堆的影響，其主要的影響因素是其自身的原料配比。

2.2 堆肥過程中的微生物數量變化

中藥渣不同配比堆肥的微生物總數變化，其中細菌數量，T1是“高—低—高”走勢，T2和T3是“高—低—高—低”走勢，T4是“低—高—低”走勢；放線菌數量，T1和T2是“低—高—低—高”走勢，T4是“低—高—低”走勢；真菌數量，T2和T3是“高—低—高—低”走勢，T4是逐漸下降（表2）。

堆肥中氮素相關微生物數量的變化，其中自生固氮菌（Azotobacter）數量，T1是逐漸下降，T2、T3 和T4是“高—低—高”走勢；氨化細菌（Ammonif i ers）的數量，T1是“高—低—高”走勢，T2和T3是“高—低—高—低”走勢，T4是“低—高—低”走勢；硝化細菌（Nitrifying bacteria）的數量，T2、T3和T4是“高—低—高”走勢；反硝化細菌（Denitrifying bacteria）的數量，T2、T3和T4是“高—低—高”走勢。說明在中藥渣堆肥過程中，由于不同處理間的原料配比不同，其高溫微生物繁殖有快有慢而導致微生物總量和氮素相關微生物菌群的變化趨勢略有不同，從而影響堆肥啟動的快慢以及氮素形態的轉化。

表2 堆肥過程中氮素相關微生物數量的變化Table 2 Changes of nitrogen-related microorganisms during composting

2.3 堆肥過程中的氮素含量變化

中藥渣不同配比堆肥的全氮含量都呈現初期先是略微升高，再緩慢下降，隨后又緩慢上升的趨勢（圖2）。在堆肥7 d時，有機物料不同配比堆肥的全氮含量基本達到最高，其中T4的含量最高，為13.41 g/kg；堆肥結束后，T3全氮含量最高，為9.86 g/kg，其次是T4，為7.66 g/kg，最低是T1，為4.91 g/kg。

堆肥的銨態氮含量變化中，T1是先降低后上升；T2是先降低后上升，再下降，最后上升；T3和T4是先升高再降低，再上升。在堆肥過程中，T1的銨態氮含量在堆肥初期時最高，為2.97 g/kg；T2的銨態氮含量在堆肥21 d時達到最高，為2.96 g/kg；T3和T4的銨態氮含量在堆肥7 d時達到最高，分別3.64和4.41 g/kg；T1的銨態氮含量在堆肥28 d時堆肥降到過程中的低谷，為1.13 g/kg；T2的銨態氮含量在堆肥14 d時降到堆肥過程中的低谷，為1.86 g/kg；T3和T4的銨態氮含量在堆肥21 d時降到堆肥過程中的低谷，分別為1.4和1.04 g/kg。

堆肥過程中的硝態氮含量都是呈現先略微緩慢下降后再上升的趨勢。在整個堆肥過程中，在堆肥0～14 d時，4個不同中藥渣配比處理硝態氮含量的變化趨勢一致且相差不大；堆肥14～35 d時，T1和T2硝態氮含量的變化趨勢一致，而T3和T4硝態氮含量的變化趨勢一致，且同期的硝態氮含量要高于的T1和T2；堆肥35 d時，T3的硝態氮含量最高，為3.41 g/kg，其次為T4，為3.33 g/kg。通過了解中藥渣不同配比堆肥過程中的全氮、銨態氮和硝態氮含量的變化以及相關關系，從而有利于減少堆肥過程中的氮素損失。

圖2 堆肥過程堆體氮含量的變化Fig. 2 Changes of N contents during composting

2.4 堆肥過程中的種子發芽指數變化

種子發芽指數（GI）是檢驗堆肥腐熟度的一種最直接和有效的方法[22]。未腐熟的堆肥含有植物毒性物質，對植物的生長產生抑制作用，因此可用種子發芽指數來評價堆肥腐熟度。當GI＞50%時，表明這種堆肥已達到可接受的腐熟度，可認為堆肥基本無毒性；若GI＞80%則表明堆肥已達到完全腐熟[23]，對植物完全沒有毒性。

在中藥渣堆肥過程中，不同處理的種子發芽指數趨勢基本相同，都是隨堆肥的進行先緩慢降低再逐漸升高。T1和T2堆肥0～21 d時，種子發芽指數緩慢下降，21～35 d種子發芽指數逐步上升；T3和T4堆肥0～14 d時，種子發芽指數緩慢下降，14～35 d種子發芽指數逐步上升。T1和T2的發芽指數在堆肥進行21 d最低，分別為13.34%和16.85%，而T3和T4的發芽指數在堆肥進行14 d最低，分別為17.57%和15.1%。T3在堆肥進行28 d后發芽指數大于50%，而T3在堆肥進行35 d后發芽指數才大于50%，并且在堆肥進行28 d后發芽指數才大于50%。堆肥結束后，T3的發芽指數最大，為74.37%，其次是T4和T2，分別為58.4%和42.87%，而T1最小，為34.37%（圖3）。說明不同中藥渣配比堆肥35 d后，T3的堆肥已經接近完全腐熟，而T4的堆肥才基本腐熟，T1和T2還未腐熟。

圖3 堆肥過程中種子發芽指數的變化Fig. 3 Change of germination index during composting

2.5 堆肥前后NPK養分變化

堆肥結束后，N和P2O5含量都以T3處理最大，分別為9.86和23.76 g/kg，K2O含量以T3處理最大，為6.79 g/kg，有機質和水分含量以T1最大，分別為55.86%和45.53%（表3）。N、P2O5和K2O含量都以T1處理最小，分別為4.91、21.76 和6.33 g/kg，有機質和水分含量以T4最小，分別為48.8%和35.52%。單位質量中氮素損失率最小是T3處理，為4.27%，其次是T4處理，為29.13%，而損失率最大是T1處理，為53.28%；單位質量中P2O5增加率最大是T3處理，為36.55%，其次是T4處理，為36.07%，而增加率最小是T1處理，為14.05%；單位質量中K2O增加率最大是T4處理，為29.58%，其次是T3處理，為26.24%，增加率最小是T1處理，為5.68%。

表3 堆肥前后NPK養分變化Table 3 Changes of nitrogen, phosphorus and potassium contents before and after composting

3 討論

堆肥化處理是中藥渣等有機廢棄物的首選處理方式，快速腐熟是其關鍵技術之一。好氧堆肥是在有氧條件下，利用好氧微生物對有機廢棄物進行吸收、氧化和分解，微生物是好氧高溫堆肥過程的主體，微生物總數和氮素相關微生物數量的合理變化,加快堆肥升溫速度，減少氮素損失，縮短堆肥時間，提高堆肥制品質量，是目前國內外常用和比較經濟、行之有效的成熟處理農業廢棄物的方法[8]。

高溫好氧堆肥主要通過微生物的作用來實現，其產生的高溫是由微生物降解有機物產生的，因此堆肥的溫度變化是反映堆肥發酵是否正常最直接、最敏感的指標，堆肥初期微生物的數量多、活性強，堆肥發酵啟動就好，溫度上升快，反之，則堆肥發酵啟動就差，溫度上升慢。堆肥中期微生物的數量多、活性強，高溫維持就較好，堆肥發酵時間短；反之，高溫維持就較差，需要延長堆肥發酵時間。在中藥渣好氧堆肥過程中，去除混合的原始樣外，細菌總數至少是放線菌和真菌的10 000倍以上，所以在好氧堆肥過程中，起主導作用就是細菌的數量和活性[24-25]。從試驗的數據分析來看，除去個別的數據，發現細菌、放線菌和真菌數量基本上是呈現“高—低—高—低”走勢，主要是堆肥前期是由有機原料本身帶來的土著菌或者在自身發酵過程中形成的低溫發酵菌，隨著好氧高溫堆肥的進行，一些低溫菌（包括細菌、放線菌和真菌）的活性被抑制或者殺死導致數量銳減，而高溫菌（包括細菌、放線菌和真菌）正在逐步繁殖，未大量繁殖之前表現是微生物數量下降，大量繁殖之后表現的是微生物數量上升，隨著堆肥的后移，有機質被分解，養分被消耗而趨之平衡，高溫好氧微生物數量下降，溫度逐步降低，一些特征高溫微生物又開始逐漸繁殖起來。試驗中，由于T1的堆肥原料配比原因，高溫好氧微生物繁殖緩慢，溫度緩慢上升，堆肥7 d時低溫細菌減少，高溫細菌數量未大量繁殖，表現為細菌數量的下降，后來高溫好氧細菌繁殖增多，表現為細菌數量的上升，堆肥35 d時相比其他處理，正在高溫階段，堆肥好氧細菌正在急劇繁殖和活躍中，因此還需要延長其堆肥發酵時間；而T4的細菌“低—高—低”走勢，細菌變化趨勢并沒有像T1、T2和T3那樣呈現出“高—低—高—低”走勢，先有一個下降過程，其實是由于T4的原料配比更適合好氧微生物的大量繁殖，在7 d取樣檢測的時候恰恰是大量繁殖高溫細菌、放線菌和真菌。

堆肥過程中氮素轉化是微生物所驅動[26]。堆肥初期，溫度開始升高，高溫好氧微生物繁殖，消耗部分銨態氮和硝態氮用于微生物的生長，而高溫硝化細菌并未大量繁殖，表現為硝態氮的含量略微降低，同時自生固氮菌數量減少，活性減弱，低溫氨化細菌死亡，高溫氨化細菌逐漸繁殖，氨化作用增強，有機氮向銨態氮大量轉化，銨態氮含量逐漸增多，表現為銨態氮的升高，而此時銨態氮發生揮發損失少，部分自生固氮菌能固定空氣中的氮，而碳水化合物被大量的微生物消耗分解，物料干重的下降，總氮含量相對升高。隨著氨化細菌的氨化作用增強，以及持續高溫的影響，導致了部分銨態氮的揮發，同時硝化細菌的硝化作用將部分銨態氮轉化成硝態氮[15]，從而降低了銨態氮的含量，而銨態氮的揮發和反硝化細菌將部分硝態氮的反硝化造成的氣態氮素損失[15]，又導致總氮含量相對降低。然后，隨著高溫硝化細菌的繁殖，硝化作用增強，銨態氮經過硝化作用轉化成硝態氮[27]，隨著硝態氮積累而增多，有機物料的營養逐漸消耗，趨之穩定，氨化細菌減少，活性減弱，氮揮發損失減弱，以及有機物進一步降解，銨態氮含量和全氮含量又相對增加，故各處理的全氮和銨態氮含量隨著堆肥的進程表現為先升高后降低，再緩慢升高，而硝態氮含量的變化表現為先略微降低后緩慢升高。T1和T2的銨態氮先是緩慢下降，而T3和T4的銨態氮是先急劇升高，主要原因就是T3和T4的高溫氨化細菌繁殖更加迅速，氨化作用強，銨態氮轉化增多含量高些，而T1和T2的高溫氨化細菌繁殖緩慢，氨化作用弱，銨態氮轉化少，同時微生物生長本身需要部分銨態氮，所以含量相比低些，并且銨態氮的含量隨著堆肥中氨化細菌數量增多而升高。

相比其他處理，T1前期升溫慢，堆肥進行到中后期溫度才維持65 ℃左右，堆肥35 d后的全氮含量最低，發芽指數相對最低，才34.37%，主要是由于四磨湯中藥渣添加量比例較高（中藥渣=75%），其中藥渣是由枳殼、檳榔、烏藥、木香混合經過水提后無法提取的生物堿、內酯以及還殘留一些黃酮類等抑菌物質[28-29]，抑制了堆肥好氧微生物的生長，使其堆肥前期升溫慢，溫度相對也較低，隨著堆肥的進行，部分抑菌物質被分解后，堆肥好氧微生物逐漸繁殖起來了，中后期堆肥的溫度才有較高溫度，但是高溫維持時間短，有機物料未腐熟，同時有機質分解少，堆體的絕對干質量變化小，而有機氮隨著氨化作用的進行而揮發，所以T1堆肥結束時的全氮含量相比其他處理低，發芽指數小意味著堆肥腐熟效果差，要達到堆肥完全腐熟，需要延長其堆肥時間。T4的中藥渣添加量比例相對較少，雖然含有黃酮類、生物堿和內酯等抑制物質，但是比例較低（中藥渣=30%），其堆肥好氧微生物的生長繁殖快，使其堆肥前期升溫快，但是高溫階段的溫度高，部分高溫菌的生長也受到抑制，堆肥相比差點，種子發芽指數低，影響了堆肥腐熟效果。T3的中藥渣添加量比例比較（中藥渣=45%），其含有黃酮類、生物堿和內酯等抑制物質在分解過程中起到控制部分微生物菌落的變化，有利于堆肥溫度維持在62℃左右，促進高溫微生物的相互協調堆肥，減少的氮素損失，同時有利于快速堆肥。在4個不同配比處理堆肥中都使用了大量的蘆葦渣、四磨湯中藥渣等纖維素、木質素含量高的物質，其原料本身的氮、磷和鉀的含量相對較低，導致堆肥后，總養分的含量沒有達到國標的要求（總養分含量≥5%），因此在此類原料進行堆肥時需要增加一些養分豐富的畜禽糞便等原料。

4 結論

1）以中藥渣廢棄物為主要原料進行高溫好氧堆肥過程中，起主導作用的是細菌，同期其單位質量的數量是放線菌和真菌至少10 000倍，控制其數量和活性的變化是最有效影響著堆肥的快慢和有機肥料的品質。

2）中藥渣堆肥過程中的細菌、氨化細菌數量變化是“高—低—高—低”走勢，而自身固氮菌、硝化細菌和反硝化細菌數量變化是“高—低—高”走勢，揭示了氮素關鍵菌群是如何影響氮素形態的變化，為減少中藥渣廢棄物堆肥過程中的氮素損失提高技術參考。

3）在利用中藥渣為主要原料進行好氧快速堆肥時，中藥渣的配比一般在45%比較合理，其堆肥溫度維持在62 ℃左右，有利于快速堆肥并減少氮素損失，提高中藥渣有機廢棄物的堆肥效率。

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