臨床分離沙門菌的耐藥性及超廣譜β-內酰胺酶類耐藥基因

曲 梅，黃 瑛，張 新，呂 冰，錢海坤，王全意

(北京市疾病預防控制中心 北京市預防醫學研究中心 食物中毒診斷溯源技術北京市重點實驗室，北京 100013)

沙門菌是一種重要的人畜共患病原菌，是引起感染性腹瀉和食源性疾患最重要的致病菌之一。隨著抗菌藥物的廣泛使用，沙門菌耐藥問題日趨嚴重，耐藥水平越來越高，多重耐藥菌的頻繁出現，已成為嚴重的公共衛生問題。β-內酰胺類抗生素(β-lactam antibiotic)是指化學結構中含β-內酰胺環的一大類抗生素(主要包括青霉素類、頭孢菌素類、頭霉素類、單環內酰胺類及其他非典型β-內酰胺類抗生素)。產超廣譜β-內酰胺酶(extended-spectrum β-lactamases，ESBLs)是革蘭陰性菌耐藥最常見的機制，約占總耐藥機制的80%[1]。編碼ESBLs的基因分為blaTEM、blaCTX-M、blaOXA和blaSHV及其他5種基因型[2]，呈全球分布，可由染色體外的質粒攜帶，通過融合、轉導和轉化等機制在細菌間傳遞轉移，從而擴大耐藥性的傳播與分布，引發感染暴發。目前，臨床上治療沙門菌感染性腹瀉，多使用β-內酰胺類抗生素，因而對其耐藥的菌株也不斷出現。本研究對北京市臨床分離的非傷寒沙門菌株進行藥物敏感性分析及ESBLs基因的檢測，為指導臨床合理使用抗菌藥物，控制沙門菌的流行和疾病傳播，有效應對耐藥菌株的擴散提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 2012—2015年在北京市7個監測區縣選取17家腸道門診，每個監測區縣每周采集10～15份急性感染性腹瀉患者新鮮糞便標本。按照北京市腸道傳染病監測方案的要求進行規范采樣，共收集16 349份標本，進行沙門菌的分離、培養和鑒定，分離出非傷寒沙門菌677株。急性感染性腹瀉的診斷標準為日腹瀉次數>3次，比平時次數增多；大便形狀改變，呈稀便、水樣便、黏液便或膿血便，原則上就診前未使用過抗菌藥物。

1.2 方法

1.2.1 分離、培養及生化鑒定 糞便沙門菌的分離培養參照衛生部行業標準WS271-2007附錄B進行。采集患兒的糞便或肛拭子，插入亞硒酸鹽煌綠(selenite brilliant green，SBG)增菌液肉湯培養(37℃，18～24 h)，在SS選擇性培養基進行劃線分離培養(37℃，18～24 h)；挑取可疑單菌落，穿刺三糖鐵瓊脂，于37℃培養18～24 h，斜面呈紅色，底層黃色、產氣，硫化氫陽性為可疑沙門菌。將分離到的可疑沙門菌轉種于營養瓊脂培養基上過夜培養，采用法國梅里埃公司VITEK 2 Compact全自動微生物鑒定系統進行系統生化鑒定。上述培養基為英國OXOID公司產品。

1.2.2 血清學分型試驗 用沙門菌群(A～F)抗原、菌體(O)抗原及鞭毛(H)抗原的不同抗血清對沙門菌進行血清型鑒定。方法為挑取三糖斜面上少量菌苔與A～F多價抗血清在室溫下進行玻片凝集，1 min 內出現凝集顆粒為陽性；按同樣方法與O單價抗血清進行逐一凝集確定O抗原，根據確定的O抗原進行相應的H多價和單價血清凝集，以確定最終血清型。玻片凝集時需設生理鹽水對照。沙門菌診斷血清為丹麥SSI血清研究所產品，均在有效期內使用。

1.3 ESBLs 耐藥基因檢測 采用煮沸法提取菌體及質粒DNA。PCR擴增反應體系為25 μL，包含12.5 μL 2×PCR反應混合物，上、下游引物0.2 μmol/L，模板DNA 2 μl；反應條件：94℃預變性5 min，94℃變性30 s ，退火30 s ，72 ℃ 延伸1 min，35 個循環，72℃延伸5 min。OXA、TEM、SHV、PSE和CTX-M 型基因引物序列[4-5]及反應條件見表1，引物序列由北京擎科生物技術有限公司合成。PCR擴增在美國ABI9700 PCR儀上進行，PCR擴增產物用德國QIAGEN公司QIAxcel 全自動電泳系統進行檢測，PCR 陽性擴增產物交于北京擎科生物技術有限公司純化、雙相測序。序列拼接后通過NCBI Blast 程序在GenBank 上查詢比較，確定基因亞型。

表1 ESBLs耐藥基因PCR引物及序列

2 結果

2.1 分離沙門菌及血清型分布 2012—2015年從16 349份腹瀉臨床樣本中共分離非傷寒沙門菌677株，陽性率為4.14%。其中2012年采樣3 364份，陽性率5.68%；2013年采樣3 314份，陽性率4.01%；2014年采樣2 781份，陽性率4.17%；2015年采樣6 890份，陽性率3.44%。677株沙門菌共分為68種不同的血清型，其中腸炎沙門菌為最主要的血清型，占35.45% (240株)，其次為鼠傷寒沙門菌(111株，16.40%)、山夫登堡沙門菌(61株，9.01%)、鼠傷寒沙門菌變種(45株，6.65%)。見表2。

表2 677株沙門菌血清型分布

表3 677株沙門菌對16種抗菌藥物的耐藥結果

表4 沙門菌多重耐藥結果

2.3 β-內酰胺酶類耐藥基因檢測 677株非傷寒沙門菌中選取對氨芐西林和阿莫西林/克拉維酸均耐藥的244株沙門菌，進行blaTEM、blaCTX-M、blaOXA、blaSHV和blaPSE-15種ESBLs基因的檢測，其中blaSHV和blaPSE-1未檢測到，陽性基因電泳結果見圖1，基因片段測序峰圖見圖2。blaTEM檢出率最高(59.84%，146/244)，經測序確證全部為blaTEM-1；30株(12.30%)blaOXA-1陽性，18株(7.38%)blaCTX-M陽性，其中包括7株blaCTX-M-15，6株blaCTX-M-55和5株blaCTX-M-14；154株(63.11%)攜帶一種ESBLs耐藥基因；20株(8.20%)同時攜帶2種ESBLs耐藥基因，其中blaTEM-1和blaOXA-1雙陽性的菌株12株，blaTEM-1和blaCTX-M雙陽性的菌株8株，見表5。所有ESBLs基因陽性的菌株對頭孢菌素的耐藥性不同，18株blaCTX-M基因陽性的菌株頭孢菌素耐藥表型符合率最高，對頭孢曲松的耐藥率為88.89%(16/18)，對頭孢吡肟的耐藥率為77.78%(14/18)，對頭孢西丁的耐藥率僅為5.56%(1/18)。

圖1 耐藥基因毛細管電泳結果

Figure1Capillary electrophoresis result of drug resistance genes

A:blaOXA基因;B: blaTEM基因;C: blaCTX-M基因

Table5Detection results of ESBLs drug resistance genes of 244Salmonellastrains

耐藥基因型菌株數blaTEM-1146blaOXA-130blaCTX-M18 blaCTX-M-157 blaCTX-M-556 blaCTX-M-145blaTEM-1+blaOXA-112blaTEM-1+blaCTX-M8 blaTEM-1+blaCTX-M-154 blaTEM-1+blaCTX-M-143 blaTEM-1+blaCTX-M-551

3 討論

沙門菌引起的感染性腹瀉與諾如病毒一樣全球分布[6-7]，尤其在發達國家和地區更是高發，在我國感染性腹瀉中位居第3位。許多沙門菌可在人、動物、食品和外環境之間相互傳播，導致人和動物發病。北京市2012—2015年自感染性腹瀉病例中分離沙門菌677株，檢測出68種血清型，腸炎沙門菌和鼠傷寒沙門菌為優勢血清型，與國內其他研究[3,8-9]類似，只是在優勢血清型分布順序上略有差別。北京、上海以腸炎沙門菌為第一位，而廣東和河南則以鼠傷寒沙門菌為第一優勢血清型，可見沙門菌血清型分布廣泛，并具有區域特異性。本研究顯示，山夫登堡沙門菌和阿貢納沙門菌是臨床常見的2種沙門菌致病血清型，其中山夫登堡沙門菌可在環境中持續存在，成為潛在的污染源，并造成腹瀉病例的持續發生[10]。阿貢納沙門菌曾引起過多起聚集性腹瀉疫情，有報道[11]阿貢納沙門菌污染奶粉引起新生兒感染導致腦膜炎。因此，明確鑒定沙門菌血清分型，了解本地區近幾年沙門菌主要病原構成情況，掌握其血清學變遷，為臨床診療提供病原學依據。

CTX-M型ESBLs是一組逐漸被認識且家族成員日益龐大的新型ESBLs，該類酶最早由鼠傷寒沙門菌產生，以對頭孢噻肟高水平耐藥為主要表型特征。blaCTX-M基因亞型及菌譜地域分布廣泛，是導致某些地區ESBLs 產酶株傳播或流行的主要原因。本研究對頭孢曲松耐藥的沙門菌進行檢測，檢出3種基因亞型blaCTX-M-15、blaCTX-M-55和blaCTX-M-14，在我國其他地區也有此3種基因亞型的檢出，提示上述亞型的ESBLs 在我國存在一定的流行，但由于各地區使用抗菌藥物不同，blaCTX-M流行基因亞型也有差異，深圳和江西報道的流行亞型為blaCTX-M-14[13-14]，而遼寧地區則以blaCTX-M-55為主[15]。

由于ESBLs家族基因種類繁多，本研究僅選取了研究比較多的經典的5種基因。在244株沙門菌中，71.31% 的菌株攜帶上述1種以上ESBLs耐藥基因，但文獻報道還有很多編碼其他類型酶，如BES-1、FEC-1、PER-2、CME-1、VEB-1等的基因[2]，難免會造成一些表型ESBLs耐藥菌株基因型的漏檢。由于細菌的耐藥機制相當復雜，耐藥基因的位置、遺傳結構和表達情況以及不同耐藥基因之間的相互作用等均會影響細菌對抗菌藥物的耐藥性，產ESBLs菌株不僅對青霉素類和頭孢菌素耐藥，而且對氨基糖苷類、喹諾酮類、磺胺類藥物也交叉耐藥。耐藥表型與耐藥基因存在密切的關系，但又并非遵循嚴格的對應關系，細菌對一種藥物的耐藥可能是幾種耐藥基因和耐藥機制共同作用的結果[16]。因此，擴大ESBLs菌株耐藥基因監測的種類，是后續研究關注的重點和有待完善的方面。

[參 考 文 獻]

[1] Jacoby GA, Archer GI. New mechanism of bacterial resistance to antimicrobial agents[J]. N Engl J Med， 1991， 324(9)： 601-612.

[2] Bradford PA. Extended-spectrum beta-lactamases in the 21st century: characterization, epidemiology, and detection of this important resistance threat[J]. Clin Microbiol Rev, 2001, 14(4): 933-951.

[3] Ke B， Sun J， He D， et al. Serovar distribution, antimicrobial resistance profiles, and PFGE typing ofSalmonellaentericastrains isolated from 2007-2012 in Guangdong, China[J]. BMC Infect Dis， 2014， 14： 338.

[4] Wang Y，Yang B， Wu Y，et al. Molecular characterization ofSalmonellaentericaserovar Enteritidis on retail raw poultry in six provinces and two National cities in China[J]. Food Microbiol， 2015， 46： 74-80.

[5] Sidjabat HE， Paterson DL， Adams-Haduch JM， et al. Molecular epidemiology of CTX-M-producingEscherichiacoliisolates at a tertiary medical center in western Pennsylvania[J]. Antimicrob Agents Chemother， 2009， 53(11)： 4733-4739.

[6] 陳艷偉，高志勇，嚴寒秋，等. 2011—2015年北京市腸道門診老年腹瀉患者諾如病毒感染的流行特征分析[J].國際病毒學雜志，2017，24(1)：36-39.

[7] 周瑩，祁亮梁，梁俊榮，等. 北京市東城區5歲以下嬰幼兒病毒性腹瀉病原學研究[J].國際病毒學雜志，2017，24(2)：119-122.

[8] 許學斌，顧寶柯，金匯明，等. 上海市沙門氏菌血清型流行特征[J].中國人獸共患病學報，2009，25(2)：156-158.

[9] 趙嘉詠，黃麗莉，穆玉姣，等. 2011—2013年河南省鼠傷寒沙門菌耐藥與分子分型研究[J].中國人獸共患病學報，2016，32(1)：56-60.

[10] 曲梅，黃瑛，張新，等. 2008—2014年北京市山夫登堡沙門菌耐藥性及分子流行病學特征分析[J]. 現代預防醫學，2016，43(14)：2497-2501.

[11] Cooke FJ， Ginwalla S， Hampton MD， et al． Report of neonatal meningitis due toSalmonellaentericaserotype Agona and review of breast milk-associated neonatalSalmonellainfections[J]. J Clin Microbiol， 2009， 47(9)： 3045-3049.

[12] 崔海洋，王宵雪，霍哲，等. 76 株沙門菌耐藥譜及耐藥基因分析[J].中國衛生檢驗雜志，2016，26(1)：136-138.

[13] 吳偉元，王輝，陸堅，等. 深圳社區感染沙門菌耐藥基因調查與同源性分析[J].中華檢驗醫學雜志，2011，34(5) ：431-436.

[14] 陳強，余曉君，李俏俏，等.引起兒童腹瀉的沙門菌屬臨床分離株的耐藥特點及分子流行病研究[J]. 中華檢驗醫學雜志，2011，34(3)：249-253.

[15] 夏夢，張智潔，劉勇. 152 株沙門菌臨床分離株的耐藥性及同源性分析[J].醫學臨床研究，2014，31(12)：2311-2317.

[16] Kariuki S， Gordon MA， Feasey N， et al. Antimicrobial resis-tance and management of invasiveSalmonelladisease[J]. Vaccine， 2015， 33(Suppl 3)： C21-C29.