某院結核分枝桿菌利福平和異煙肼耐藥基因特征

劉厚明，陳 珊，黃莎莎，單萬水

(1 深圳市第三人民醫院，廣東 深圳 518112；2廣東醫科大學，廣東 湛江 524002)

結核病是由結核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis, MTB)感染引起的一種對人類健康危害嚴重的慢性傳染病。2015年全球新增結核病例1 040萬，新增耐多藥結核病例48萬，超半數來自印度、中國和俄羅斯[1]。結核病是2016年傳染性疾病中排名第一的死亡原因[2]。我國現有427萬活動性肺結核患者，是全球30個結核病高負擔國家之一，新發結核病病例位居全球第三，新增耐多藥結核患者數居全球第二[3]。耐多藥結核病(multidrug-resistant tuberculosis，MDR-TB)是指結核病患者感染的MTB至少同時對利福平(rifampicin, RFP)和異煙肼(isoniazid, INH)產生耐藥性[4]。2015年我國每10位結核病患者中僅有3位得到準確診斷，每100位MDR-TB患者僅有5位獲得有效治療[5]。目前，快速檢測MTB耐藥相關基因的方法在全球范圍內日益增多，國內各地區積極開展研究地區耐藥基因突變特征，以期獲得快速分子檢測信息。本研究通過基因測序法分析結核分枝桿菌RFP耐藥相關基因rpoB和INH耐藥相關基因katG、inhA啟動子的突變情況，探討某院耐藥結核分枝桿菌臨床分離株ropB、katG 和inhA 基因突變特征及其與耐藥性的相互關系，為新興MDR-TB分子診斷技術在本地區的應用提供理論支撐，也為該院制定耐藥結核病防治規劃提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 收集2012年8月—2014年5月某市傳染病專科醫院住院患者送檢痰標本分離培養的MTB 83株，菌株來源包括新發和復發患者，年齡為15～77歲；男性56例，女性27例。所有MTB DNA標本均保存于-70℃冰箱并統一進行相關耐藥基因突變位點檢測。

1.2 研究方法

1.2.1 菌株分離鑒定及藥敏試驗 嚴格按照國家結核病細菌學檢驗標準化規程進行試驗，標本用BACTEC MGIT 960全自動分枝桿菌培養儀培養，培養陽性的菌株進行抗酸染色，利用實時熒光定量PCR進行菌種鑒定。采用世界衛生組織(WHO)推薦的比例法對RFP、INH、鏈霉素和乙胺丁醇進行敏感性試驗，4種藥物在培養基中的臨界濃度分別為1、0.1、1和5 mg/L，根據待測管與空白對照管中分枝桿菌的生長情況對比判斷該藥的敏感性，結果判讀為耐藥(R)或敏感(S)。

1.2.2 細菌DNA的制備 吸取一定量的液體培養基中生長的MTB，在80℃恒溫箱中滅活60 min，使用 Qiagen公司的細菌基因提取試劑盒提取基因組DNA，操作按說明書進行。

1.2.3 引物設計與合成 通過https://www.ncbi.nlm.nih.gov/的genebank獲得標準株H37RvrpoB、katG和inhA基因全序列，采用primer premier 5.0設計引物，引物由北京六合華大基因科技股份有限公司合成，引物序列見表1。

1.2.4 目的基因的擴增與測序 PCR反應體積為50 μL，包括3 μL模板，5 μL 10× LA PCR Buffer II，2.5 μL引物，8 μL dNTP混合液，0.5 μL Taq PCR master mix，31 μL去離子水。擴增條件： 94℃變性1 min；94℃30 s，58℃30 s，72℃210 s，30個循環；72℃延伸7 min。PCR產物送華大基因公司進行純化和測序，測序結果與MTB標準株H37Rv序列比對分析。

1.3 統計分析 應用SPSS 19.0統計軟件進行數據分析,計數資料采用χ2檢驗，P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 藥敏結果 收集的83株MTB臨床樣本中，耐藥株60株，全敏感株23株。其中RFP耐藥株39株，敏感株44株；INH耐藥株51株，敏感株32株；對RFP及INH同時耐藥30株。

2.2 RFP耐藥相關基因rpoB的突變特征 39株RFP耐藥株中有38株檢測到rpoB基因突變，突變率達97.44%(38/39)，其中36株在rpoB基因81bp的基因核心區域內發生突變，2株在1 156位點發生突變。測序結果顯示，39株RFP耐藥株中共發現19種突變形式，其中9種為本研究新發現的突變類型，主要包括兩個以上密碼子聯合突變、點突變、同一密碼子雙重突變，未發現堿基插入或缺失。突變菌株中單位點突變有6株(15.79%)，多位點聯合突變有32株(84.21%)。最常見的突變位點為531位點，突變率達60.53%(23/38)，變化形式主要由組氨酸(His)突變為亮氨酸(Leu)或酪氨酸(Tyr)；其次的突變位點為526位點，突變率為23.68%(9/38)。44株RFP敏感菌株中有31株檢測到突變，其中1 156位點同義突變占80.65%(25/31)。見表2。

表2 83株MTB RFP耐藥相關基因rpoB突變特征

注：NMa為無基因突變；b為TBDReaMDB結核分枝桿菌數據庫(http://www.tbdreamdb.com)中未報道位點；c為氨基酸同義突變，該位點在TBDReaMDB結核分枝桿菌數據庫中未見報道；突變前后改變氨基酸使用一字碼簡寫；TBDReaMDB結核分枝桿菌數據庫查詢日期為2017年7月25日

2.3 INH耐藥相關基因katG、inhA的突變特征 98.04%(50/51)的INH耐藥株在katG基因出現突變，其中14株為單位點突變，36株存在多位點聯合突變。14株單位點突變菌株中，有8株為katG 315位點突變；36株多位點聯合突變菌株中，有27株為katG 315位點突變；katG 315位點突變率為70.00%(35/50)。32株INH敏感菌株中未發現katG 315位點突變。katG 463位密碼子在耐藥株和敏感株中均檢測到突變，突變率分別為74.51%(38/51)、59.38%(19/32)，兩者突變率比較，差異無統計學意義(χ2=2.09，P=0.15)。51株INH耐藥株中僅1株檢測到inhA 21位點突變，且為inhA 21位點與katG 463位點聯合突變，其余50株分離株inhA 21位點基因序列與標準株H37Rv序列均一致；INH敏感株未檢測到inhA 21位點基因突變。見表3。

表3 83株MTB分離株katG、inhA基因突變情況

*：為inhA基因上的密碼子；NMa為無基因突變；b為TBDReaMDB結核分枝桿菌數據庫(http://www.tbdreamdb.com)中未報道位點；c為氨基酸同義突變，該位點在TBDReaMDB結核分枝桿菌數據庫中未見報道；突變前后改變氨基酸使用一字碼簡寫；TBDReaMDB結核分枝桿菌數據庫查詢日期為2017年7月25日

3 討論

21世紀以來，隨著耐藥MTB的出現和傳播，全球結核病疫情呈現死灰復燃的態勢，耐藥結核病患者尤其是耐多藥及廣泛耐藥性結核病患者逐年增加，給公共衛生安全帶來嚴重威脅。INH和RFP作為目前使用最廣泛的一線抗結核藥物，在MTB耐藥譜中高居前2位[6]，而INH和RFP較高耐藥率的出現，主要與其耐藥基因突變相關[7]。全國各地區關于MTB耐RFP和INH相關基因的突變頻率存在差異，因此，以地區為單位研究MTB耐藥基因的突變特征對各地區開展結核病防治工作有重大意義。

rpoB是MTB RNA聚合酶β亞單位的編碼基因，長約3 534 bp，編碼1 178個氨基酸。大量研究[8-9]表明，90%～97%耐RFP的MTB是由rpoB基因內的RFP耐藥基因核心區(rifampicin resistance determining region，RRDR)發生突變引起。本研究結果顯示，83株MTB中有39株出現RFP耐藥，RFP耐藥率為46.99%，耐RFP菌株中檢測到rpoB基因RRDR區域內突變36株，突變率達92.31%(36/39)。本研究中不計入同義突變類型，最常見的突變位點是531、526位點，突變頻率分別為60.53%(23/38)和23.68%(9/38)，兩位點突變頻率之和占84.21%(32/38)；其中531位點突變頻率高于湖南報道的51.1%[10]和江蘇報道的55.4%[11]，低于新疆地區報道的73.6%[12]，說明地區間rpoB 531突變頻率存在一定差異。此外，發現有3株菌在RRDR區內出現雙堿基突變，以rpoB 511和516位點、rpoB 516和526位點以及rpoB 526和533位點聯合突變的形式存在，考慮可能rpoB 511、516和533位點突變與RFP低濃度耐藥有關[13]。RRDR區域外發現2個同義突變位點D382D和A1156A，可能與RFP耐藥無關[14]。本研究還檢測到10個未被TBDReaMDB結核分枝桿菌數據庫收錄的E162G、T240P、G317D等位點，這些位點以與RRDR區的rpoB 531、526、516、511等位點聯合突變的形式存在，分析這種聯合突變類型中RRDR區的突變位點可能對MTB耐RFP起主導作用，區域外與之聯合突變的位點與RFP耐藥的相關性并不明確，也許有協同作用，也可能與RFP耐藥無關，尚待日后研究。本研究中發現MTB耐RFP以rpoB 531位點突變為主，其次是526位點，與2012年廣東地區報道[15]rpoB基因突變特征相似，說明檢測此兩位點存在突變與否可以作為該地區MTB對RFP耐藥性的分子診斷依據。

INH是前體藥物，通過被動擴增進入MTB菌體內，能抑制細胞壁分枝菌酸的合成，從而破壞其完整性以達到殺菌目的。INH耐藥機制復雜，涉及katG酶、烯酰脂酰載體蛋白還原酶(inhA)、β-酮酰基運載蛋白合成酶(kasA)、烷基過氧化氫還原酶(ahpC)和還原型輔酶I脫氫酶(ndh)等基因。據研究報道， 85%以上INH耐藥株存在katG基因和inhA-15位點突變[16-18]。本研究中，83株MTB菌株有51株耐INH，耐藥率為61.45%，檢測到katG基因序列突變為50株，突變率為98.04%(50/51)，僅1株檢測到inhA突變，表明katG基因突變與INH耐藥相關。本次測序結果顯示，katG 315位點突變率為70.00%(35/50)，且存在katG 315突變的均為INH耐藥株，說明在該院可將katG 315突變作為快速檢測MTB對INH耐藥性的一個可靠標志。同時，INH耐藥株中還檢測到katG基因P100T、V196I、W191G 等8個未被TBDReaMDB結核菌數據庫收錄的突變位點，除多態性位點、同義突變和聯合突變，W191G、A264V、P325S、Y608D、G490D、N508D位點均屬單堿基有效突變，以上位點可能與INH耐藥相關，但需更多數據和相關研究證實。

inhA 基因最常見的突變位點是inhA-15和inhA-8位點，inhA 啟動子突變被證實與INH 低濃度耐藥相關[19]。本實驗中僅1株出現inhA基因突變，占突變株的2.00%(1/50)，低于Zhou等[20]的研究結果，與Tseng等[21]的研究結果相似，由此推測耐藥株中inhA基因突變具有地域差異性，在該院inhA基因的突變頻率偏低，但也不排除是因樣本量較少所致。除此之外，本實驗在INH耐藥株和敏感株中均檢測到katG 463(CGG-CTG)突變，據報道katG463突變是自然存在的基因多態性位點，與INH耐藥性無關[22]。

本實驗采用BD MGIT 960 RISE比例法和DNA測序法對本院耐RFP和INH的MTB相關基因的突變情況進行分析，發現30株耐多藥菌株均發生rpoB和katG基因聯合突變，說明rpoB和katG基因存在協同作用，同時發生突變可導致MTB對RFP和INH產生耐藥，且有報道[23]指出90%～95%耐RFP的MTB菌株同時耐INH，單獨對MTB進行RFP耐藥性分析可初步鑒定MDR-TB 。另外，61株耐藥株中仍有2株未檢測到相關基因突變，提示這些菌株的突變點可能出現在本實驗擴增的相關基因區域外，或是由其他耐藥機制引起，比如異源性耐藥等。一些MTB耐藥基因突變位點與表型耐藥之間的關系并不十分明確，仍需繼續研究以提高基因檢測的特異性和靈敏度。

總之，MTB耐藥基因突變情況存在地域差異，可能受樣本量大小和抽樣方式、人群遺傳背景、菌株進化背景以及環境等因素影響。醫院可通過篩檢rpoB基因的RRDR區域、katG基因高頻突變點作為初步快速判斷耐多藥MTB耐藥性的方法之一。

[參 考 文 獻]

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