芍藥苷對銀屑病小鼠皮損的治療作用及機制探討

李娜，趙穎，張曉杰，李偉寧

(1山東中醫藥大學，濟南250355；2 山東中醫藥大學附屬醫院)

銀屑病是T細胞介導的慢性炎癥疾病，特征是表皮增生、角化過度、炎癥細胞浸潤以及血管形成增加[1，2]，全球患病率為2%～3%[3]。目前研究發現，血管內皮生長因子(VEGF)家族中以VEGF-A為主，常以其水平表示VEGF水平，其受體主要包括VEGFR1、VEGFR2。研究表明[4～6],銀屑病患者血清VEGF水平與疾病嚴重程度密切相關，VEGF誘導的血管異常生成被認為是銀屑病發病機制之一。因此，調控VEGF是治療銀屑病的關鍵方法之一[7]。然而，由于復雜的病因及化療的不良反應，目前沒有較理想的銀屑病藥物用于臨床。芍藥苷(PF)是芍藥總葡萄糖苷(TGP)的主要成分，具有抗炎、免疫調節及護肝的功能。多項研究[8,9]指出，PF在銀屑病治療中具有抗炎作用，但其對銀屑病發病過程中血管生成增加是否有作用尚不清楚。2016年5月～2017年5月，我們觀察了PF對銀屑病小鼠的治療作用，并探討其是否通過調控銀屑病皮膚病變中的VEGF發揮作用。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 40只雌性8～11周齡小鼠，購自上海實驗動物中心小鼠，飼養于無病原微生物的環境，均按照動物保護及應用協會的指導說明進行。咪喹莫特(IMQ)霜(四川明欣藥業)，純度96%的PF(寧波立華植物提取技術有限公司)。制冰機(北京長流科學儀器公司)，電熱恒溫水箱(上海躍進醫療器械公司)；正置顯微鏡(Olympus公司)，石蠟切片機(Leica公司)；Quanti Fast SYBR Green PCR Kit試劑盒(Qiagen公司)，Light CyclerTM480 Ⅱ型熒光定量PCR儀(Roche公司)，低溫冷凍離心機(上海盧湘儀離心機儀器有限公司)，旋渦振蕩器(青浦瀘西儀器廠)，電動勻漿機(Fluko公司)，mini protean 3 cell電泳儀(Bio-Rad 公司)，PS-9電轉儀(大連競邁科技有限公司)；ELISA試劑盒(eBioscience公司)，MK3酶標儀(Finnpipette公司)，Tanon-5200成像系統(Tanon公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物分組、造模與用藥處理 將40只小鼠隨機分為4組，每組10只。各組將小鼠背部毛發全部剔光，用Na2S擦拭。A組小鼠背部每天涂抹凡士林，連續涂抹7 d；B、C、D組小鼠均先用IMQ霜擦拭7 d(銀屑病造模)，B、C組分別腹腔注射生理鹽水、PF 200 mg/(kg·d)10 d，D組腹腔注射PF 200 mg/(kg·d)后6 h背部皮下注射重組VEGF蛋白 100 ng 10 d。 以小鼠背部出現一定范圍肉眼可見鱗屑性紅斑區域，判為銀屑病造模成功。在治療第18天小鼠被安樂死，收集皮損組織及眼眶靜脈血液標本。

1.2.2 皮損組織病理觀察 收集皮損組織，以4%多聚甲醛固定后進行石蠟包埋。從石蠟組織塊上切取4 μm厚切片，HE染色后光學顯微鏡下進行組織學分析，并行微血管計數。采用Weidner微血管計數法評價：將切片置于40倍顯微鏡下確定染色最高血管密度區域，然后置于200倍顯微鏡下，選擇3個最高血管密度區進行微血管計數，求其平均值。

1.2.3 外周血VEGF蛋白檢測 采用ELISA法，按照試劑盒說明書進行操作。

1.2.4 皮損組織VEGF、VEGFR1、VEGFR2 mRNA檢測 采用實時定量PCR法。利用TRIzol試劑抽提小鼠背部皮膚組織總RNA，以M-MLV反轉錄酶體系將總RNA(1 μg)反轉成cDNA。用于GADPH、VEGF、VEGFR1、VEGFR2基因檢測的RT-PCR引物序列，見表1。實時定量PCR反應體系：SYBR Green Mix 12.5 μL，上下游引物各0.5 μL，ddH2O 9.5 μL，cDNA模板2 μL。PCR反應條件：95 ℃ 3 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40個循環；最后72 ℃ 5 min。以GAPDH基因作內參，應用 2-ΔΔCT方法分析相關基因VEGF、VEGFR1、VEGFR2的相對表達量。

表1 VEGF、VEGFR1、VEGFR2及內參基因PCR引物序列 (5′→3′)

2 結果

2.1 各組皮損組織病理觀察結果 B、D組皮損組織具有典型的銀屑病樣病理特征，如表皮角化過度和角化不全，棘層增厚，表皮突下延，真皮乳頭內血管增多、擴張；相比之下，A組皮損組織未見病理學異常，C組皮損組織銀屑病樣病理特征顯著減輕。A、B、C、D組皮損組織中血管數分別為(9.33±3.51)、(21.33±3.51)、(11.33±3.05)、(14.67±4.16)條，B組皮損組織中血管數多于A、C、D組(P均<0.05)，D組多于C組但無統計學差異。

2.2 各組外周血VEGF蛋白水平比較 A、B、C、D組外周血VEGF蛋白水平分別為(92.47±18.87)、(232.70±48.38)、(114.52±27.72)、(162.96±30.22)pg/mL，B組外周血VEGF蛋白水平高于A、C、D組(P均<0.05)，D組高于C組但無統計學差異。

2.3 各組皮損組織中VEGF、VEGFR1、VEGFR2 mRNA表達量比較 見表2。

表2 各組皮損組織中VEGF、VEGFR1、VEGFR2 mRNA表達量比較

注：與A組比較，aP<0.05；與B比較，bP<0.05；與C組比較，cP<0.05。

3 討論

銀屑病是最常見的慢性炎癥性增生性皮膚病之一，易復發，病情頑固且可造成全身系統損害。其主要的組織病理學改變為新生血管形成，角質形成細胞過度增生及炎癥細胞浸潤。其中，新生血管形成可能是銀屑病發病的關鍵因素之一。

銀屑病在中醫文獻中有“干癬”“松皮癬”“白疕”等名稱。中醫學一般認為，銀屑病初起多由風寒、風熱之邪侵襲，營衛失和，氣血不暢，阻于肌表，日久化熱而生；有的因脾虛失其運化，濕熱蘊積，外不能宣泄，內不能利導，郁阻于肌膚所致；或者風寒、風熱、濕熱之邪日久化熱化燥，氣血耗傷則生風化燥，肌膚失養，郁阻肌表而成；也有因享賦不足，肝腎兩虧，沖任失調而發病。近年來我們通過大量臨床經驗的積累，認為該病是身心疾病，越來越重視情志因素在誘發和加重銀屑病中的作用。將銀屑病從肝論治，在龍膽瀉肝湯的基礎上配伍平肝柔肝藥白芍，調氣機而暢情志，對銀屑病的恢復有較好的效果。

白芍味苦、酸，入肝經，能補肝血而柔肝。各路醫家用以疏肝理氣，柔肝養血，緩中止痛，平肝斂陰。其主要藥效成分被稱為白芍總苷，包括PF、羥基芍藥苷、芍藥花苷、苯甲酰和芍藥內酯苷，其中PF占90%以上。PF是一種單萜類糖苷化合物，具有抗炎、抗過敏以及免疫調節的功效。我們前期研究采用獨特的治療干預模式，造模后實驗組小鼠病變皮膚組織出現典型的銀屑病皮損特征，如表皮角化過度，角化不全，棘層肥厚，真皮和表皮炎癥浸潤，真皮乳頭內毛細血管增生、迂曲、擴張等，這些指征在PF治療后得到了明顯的緩解；相反，同時予PF和VEGF處理的小鼠銀屑病皮損重回造模小鼠水平。表明PF全身給藥可有效緩解銀屑病造成的皮膚炎癥，而PF、VEGF聯合給藥可消除這種作用[10]。

VEGF又稱血管通透因子或血管調理素，最先從腫瘤細胞分離出來，是一種能與肝素結合的二聚體糖蛋白分子，并能特異性地作用于血管內皮細胞，是目前所發現的生物體內最強、最特異的血管活性因子，能促進血管形成、增加血管通透性。VEGF在銀屑病皮損和血清中過表達，與銀屑病斑塊形成、真皮乳頭層毛細血管擴張、扭曲密切相關。因此，VEGF在銀屑病發病機制中可能起關鍵作用。VEGF家族有5個成員，分別為VEGF-A、B、C、D、E和胎盤生長因子。人體中最常見的是VEGF-A，其位于染色體6p21.3，全長14 kb，由8個外顯子和7個內含子構成，是一種35～45 kb的同型二聚體糖蛋白，由兩個亞基通過二硫鍵相連。其氨基酸序列高度保守，與血小板衍生生長因子(PDGF)及胎盤生長因子之間具有部分同源性。

VEGF有VEGFR1、VEGFR2和VEGFR3 3種受體,他們都是酪氨酸激酶受體(RTKs)，具有高親和力[11]。VEGF在銀屑病發病機制中的潛在作用與VEGF基因多態性和銀屑病患者VEGFR1、VEGFR2和VEGFR3過表達密切相關[12]。VEGFR1在正常血管發育中起重要作用，負責招募造血前體和引導單核細胞遷移；而VEGFR2則決定血管內皮細胞的遷移和增殖，其最重要的功能是增加血管通透性[13]。本研究結果顯示，VEGF、VEGFR1和VEGFR2基因水平在銀屑病小鼠的血清和皮損組織中均高表達，并且這種高表達水平在PF治療后恢復正常。PF、VEGF聯合給藥逆轉了PF對銀屑病小鼠的治療作用，這很好地解釋了VEGF在維持表皮屏障功能中的作用，表明角質細胞增生與表皮VEGF之間存在重要聯系[14]。一些研究報道指出，實驗誘導皮膚炎癥小鼠的表皮中VEGF過表達，進而誘導的炎癥反應導致出現了銀屑病的形態學、組織學和免疫學特征[15]。上述實驗結果表明，銀屑病發病機制的關鍵早期特征之一可能是通過上調VEGF及其受體引起表皮和免疫學改變。本研究中，D組皮損組織VEGF、VEGFR1、VEGFR2 mRNA表達量高于C組，差異有統計學意義；雖然D組外周血VEGF蛋白水平高于C組，皮損組織中血管數多于C組，但尚無統計學差異。這可能與本研究觀察時間較短，PF與VEGF聯合給藥已經從基因水平進行了逆轉，但外周血及組織學方面尚未產生明顯變化有關。

綜上所述，PF對銀屑病小鼠的皮損具有一定治療作用，與其抑制VEGF及其受體表達抗血管生成有關。本研究闡明了PF治療銀屑病可能的分子機制，為銀屑病的治療提供了新思路。

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