內窺鏡在模擬人結直腸癌散發性癌灶模型構建及監測中的應用

宋丹，鄭勇斌，童仕倫，肖曠，楊超，楊玉杰，黃曉東

(武漢大學人民醫院，武漢430060)

近年來，隨著內窺鏡技術的發展，使得結直腸內不典型增生病變實現了早發現、早診斷、早治療，且因創傷小、操作方便等優勢而廣泛用于臨床[1～3]。同時，科研人員也試圖將內窺鏡技術應用到小鼠結直腸癌模型構建中，并實時監測腫瘤的發生與發展[4]，如Becker等[5]建立的應用于活體小鼠的結腸鏡技術。但不同于人結腸鏡，小鼠結腸鏡成本較高，且小鼠結直腸癌模型構建相對較困難，均限制了其推廣應用[6]。因此，2015年1～12月，我們制備了攜帶Cre酶的慢病毒，經改造后的硬質內窺鏡行APCloxP/loxP基因工程鼠結直腸黏膜下注射，構建模擬人結直腸癌散發性癌灶模型，同時在慢病毒注射后應用纖維支氣管鏡實時監測腫瘤的生長情況，并與小鼠活體成像及解剖后檢測結果對比，以探索其在小鼠結直腸癌模型構建中的有效性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 4周齡健康雄性SPF級C57小鼠雌雄各取15只、4周齡健康雄性APCloxP/loxP基因工程鼠100只，SPF環境12 h晝夜交替，適宜溫度、濕度下飼養，小鼠實驗前不做禁食禁水處理。

1.1.2 設備與試劑 設備：CO2恒溫孵箱(Thermo Fisher公司)，倒置熒光顯微鏡(Olympus公司)，超凈工作臺。試劑：DMEM高糖培養基，PBS，胎牛血清(Gibco公司)，胰酶等；CaCl2轉染試劑盒(碧云天公司)，慢病毒濃縮純化試劑盒(Biomiga公司)。質粒：慢病毒載體pHIV-Ubi-Cre-EGFP-SV40-Luc-IRES-Puromycin、包裝質粒pMD2.G(addgene12259)與psPAX2(addgene12260)。

1.1.3 內窺鏡 包括硬質內窺鏡與纖維支氣管鏡(PENTAX,FB-8V)。硬質鏡上綁定2根導管(硬膜外導管替代)，1根導管連接氣體加壓設備，另1根導管用作微量注射針通道。配套設備包括圖像采集系統、氣體加壓設備及光源。

1.2 人結直腸癌散發性癌灶模型構建

1.2.1 美藍小鼠結直腸黏膜下注射 4周齡健康雄性SPF級C57小鼠30只，用0.5%戊巴比妥鈉麻醉小鼠并將其固定于操作臺上；取出硬質內窺鏡并打開成像系統、光源及氣體加壓設備，對固定好的小鼠行擴肛操作。此步驟需細致溫柔，可涂抹甘油于擴肛器上以減少損傷。肛門擴張完畢，用適量生理鹽水清潔灌腸，以保證操作視野及操作空間；導入硬質內窺鏡，使用微量注射器吸取30 μL美藍溶液，以輕柔而快速的動作將其注射至結直腸黏膜中(圖1、2)；避免反復操作，切勿刺破腸壁。注射完畢后，將小鼠放回鼠籠。觀察美藍滲漏情況，以評價該方法的可行性。

注：A:硬質內窺鏡；B:纖維支氣管鏡；C:病毒結直腸黏膜下注射操作；D:纖維支氣管鏡腸腔內檢查操作。

圖1小鼠結腸鏡系統

圖2 小鼠結直腸黏膜下慢病毒注射示意圖及腸鏡檢查情況

1.2.2 慢病毒包裝與濃縮純化 轉染前30 min，吸去細胞培養液，加入新鮮不含抗生素的完全培養基。取4 μg待轉染質粒，加入到100 μL CaCl2溶液中混勻(按6孔板的1個孔進行說明)。隨后將DNA-CaCl2溶液加入到100 μL PBS溶液中混勻，室溫孵育15 min后加入到培養板中，用細胞培養箱繼續培養。轉染后48 h，收集細胞上清液并按照Biomiga慢病毒濃縮純化試劑盒說明書進行病毒濃縮純化，收獲的病毒保存于-80 ℃冰箱待用。

1.2.3 慢病毒顆粒行小鼠灌腸 隨機選取轉基因鼠50只(灌腸組)，用0.5%戊巴比妥鈉麻醉小鼠，并將其固定于操作臺上；按前述方案擴肛后，用1 mL注射器吸取生理鹽水清潔灌腸3次；吸取30 μL病毒顆粒(病毒放置于冰上攜帶至動物房)注入結腸腸腔內，抽出注射器，按壓肛門并使小鼠取頭低腳高位保持30 min。

1.2.4 慢病毒顆粒經硬質內窺鏡行小鼠結直腸黏膜下注射 取剩余的轉基因鼠50只(注射組)，麻醉及固定操作同灌腸組；取出硬質內窺鏡，打開成像系統、光源及氣體加壓設備；對小鼠按前述方案擴肛后，用微量注射器吸取30 μL病毒顆粒(病毒放置于冰上攜帶至動物房)注射至小鼠結直腸黏膜下。

1.3 內窺鏡監測腫瘤發生 慢病毒感染后第3周開始，每周利用纖維支氣管鏡監測成瘤情況。檢查前用0.5%戊巴比妥鈉麻醉小鼠，并將其固定于操作臺上；取出纖維支氣管鏡，打開成像系統、光源及氣體加壓設備；按前述方法對小鼠擴肛，石蠟油潤滑鏡體后細致輕柔導入小鼠結直腸內，觀察腸腔內腫瘤發生情況。

1.4 小鼠活體成像監測腫瘤發生 慢病毒感染后第3周開始，每周行小鼠活體成像監測腫瘤發生及轉移情況。無菌PBS將D-熒光素鈉鹽配制成15 mg/mL，0.2 μm濾器過濾除菌后混勻，冰冷避光保存。按10 μL/g體質量濃度腹腔注射相應體積的15 mg/mL D-熒光素鈉鹽。注射入體內10～20 min(待光信號達到最強穩定平臺期)后行成像分析。

1.5 解剖取材檢測腫瘤發生及其組織病理學評價 第9周末，所有小鼠行安樂死并解剖探查，記錄腫瘤發生發展情況。同時，將盲腸至直腸的消化道取出，仔細剝離腸系膜、脂肪等腸外組織。注射器抽取PBS沖洗凈腸道，用4%多聚甲醛沖洗腸道預固定10 min后，以PBS沖洗凈多聚甲醛；沿縱軸剪開腸腔，將其鋪展開后拍照，記錄腫瘤發生的數目、位置及大小。隨后行常規石蠟包埋，4 μm切片，常規HE染色，判斷腫瘤類型。

1.6 內窺鏡的安全性評價 操作過程中，分別記錄硬質內窺鏡與纖維支氣管鏡所致結直腸穿孔引起小鼠死亡的情況。

1.7 統計學方法 采用Graphpad Prism 5.0統計軟件。兩個樣本率的比較采用χ2檢驗，Spearman等級相關分析纖維支氣管鏡檢出結果與解剖后取材檢出結果之間的關系。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 結直腸癌模型鼠構建情況 30只小鼠采用美藍行結直腸黏膜下注射實驗，23只可見結腸黏膜下隆起，且退針后未見美藍滲漏，其注射成功率為76.7%。灌腸組灌腸后第3天不明原因死亡2只，剩余48只中7只解剖取材可見腫瘤發生，腫瘤發生率為14%。注射組中3只因結腸穿孔引發膿毒血癥死亡,剩余47只中21只解剖取材可見腫瘤發生，腫瘤發生率為42%。灌腸組成瘤率低于注射組，差異有統計學意義(χ2=8.38，P<0.05)。

2.2 結直腸癌模型鼠腫瘤檢出情況 100只小鼠中，解剖取材探查發現成瘤小鼠28只、瘤塊34個，纖維支氣管鏡檢出成瘤小鼠21只、瘤塊26個(76.5%)，其中腫塊直徑<2 mm以及距離肛門超過2 cm的腫塊檢出率較低(表1、2)。纖維支氣管鏡檢出腫瘤的位置(距肛外緣距離)、大小與解剖檢測結果相關(r分別為0.99、0.97，P均<0.05)。小鼠活體成像檢出28只陽性，檢出率為100%。

表1 不同大小腫瘤纖維支氣管鏡檢出情況

表2 不同位置腫瘤纖維支氣管鏡檢出情況

2.3 內窺鏡安全性情況 注射組經硬質內窺鏡行結直腸黏膜下注射過程中，發生結腸穿孔3只，均因腹腔感染及全身膿毒血癥死亡。纖維支氣管鏡檢查過程中，兩組未發生結直腸穿孔。

2.4 組織病理學結果 所有腫塊進行常規HE染色，發現腫塊均為腺瘤。

3 討論

目前，結腸鏡檢查不僅是結直腸疾病診斷的金標準，同時可根據病情及時行鏡下微創治療，因此廣泛用于臨床[7，8]。但是，小鼠結腸鏡在小鼠結直腸癌模型構建中的應用仍不理想，一方面由于模型構建難度高，另一方面由于小鼠結腸鏡的技術要求高、成本及維修費用高，限制了它的推廣與使用[9～12]。據此，本研究試圖結合使用硬質內窺鏡與纖維支氣管鏡，探索其在小鼠結直腸癌模型構建中的應用。

截至目前，為了構建模擬人結直腸癌散發性癌灶，有研究通過將CDX2P 9.5-NLS Cre小鼠胚胎與APCloxP/loxP小鼠胚胎共移植到C57BL/6J假孕小鼠子宮中，實現結腸部位APC基因的突變，以構建原發性結直腸癌[13]；或者使用表達Cre酶的慢病毒或腺病毒對轉基因鼠灌腸，使其感染結直腸黏膜下干細胞并敲除APC基因，使干細胞突變誘發結直腸癌的發生[14，15]。然而，此類研究仍無法精確控制腫瘤的生長位置與數量，模型鼠之間同質性較低。若能將慢病毒顆粒局部注射到結直腸黏膜下，使其感染1個或多個結腸隱窩內干細胞，實現特定部位基因的敲除，便可更高效構建出模擬人的散發性癌灶。據此，我們在硬質內窺鏡基礎上進行部分改造后以替代小鼠結腸鏡，建立了內窺鏡下小鼠結直腸黏膜下慢病毒注射的方法。同時采用前期繁育的APCloxP/loxP小鼠，將攜帶Cre酶的慢病毒顆粒注射入該小鼠結直腸黏膜下，使其感染隱窩功能干細胞并修飾APC基因，從而誘發干細胞突變，構建模擬人結直腸癌散發性癌灶。

實驗前期，本研究應用硬質內窺鏡行小鼠結直腸黏膜下美藍注射訓練，其注射成功率均維持在70%以上；隨后，在進行慢病毒黏膜下注射的實驗中，其成瘤率為42%，相較于慢病毒灌腸組(成瘤率為14%)，其成功率明顯提高。由于慢病毒感染后第3周開始即可檢測到被感染部位報告基因的表達，且腫瘤一般發生在第3～9周。因此，本研究于第3周開始采用纖維支氣管鏡定期監測腫瘤的發生與發展，并記錄腫塊大小與位置。第9周末將95只小鼠行安樂死并解剖取材，病理檢查表明28只小鼠共形成34個瘤塊，其中前期纖維支氣管鏡檢出26個瘤塊，檢出率76.5%，當腫塊體積<2 mm或位置越過結腸脾曲時均較難檢出。另外，分析發現纖維支氣管鏡檢出腫瘤的位置、大小與解剖后檢查結果相關。盡管纖維支氣管鏡無法避免出現一定的漏檢情況，但仍能很好地實時監測腫瘤的發生與發展，可用小鼠活體成像法彌補，從而實現對小鼠結直腸癌發生、發展、轉移的全程監視，并可提示在合適時機進行取材。

在內窺鏡下注射慢病毒時，約4%小鼠出現結腸穿孔。為避免此種情況的發生，在注射過程中應細致輕柔，避免反復注射，選擇微量注射器，注射針頭使用石蠟油潤滑等。另外，維持穩定的氣壓在注射過程中具有重要作用，一方面可以擴大操作視野，另一方面可以展平腸內壁，從而更有利于腸黏膜下注射。行慢病毒注射前，不必禁食禁水，以免造成小鼠內環境紊亂，其結腸內容物可通過按摩小鼠腹部使其排除或使用生理鹽水灌洗。因腸壁內壓力較高，病毒注射時應緩慢推注，以免病毒溶液溢出。注射后半小時內應使小鼠維持在麻醉狀態，避免因小鼠活動造成注射部位病毒溶液溢出。 對于明顯成瘤者，在行內窺鏡檢查的同時，利用活檢鉗取材并活檢，可及時監測到腫塊發生的性質。雖然，內窺鏡的檢出率較低，但可反復在體取材進行標本研究。而活體成像不僅可監測腫瘤的發生，還可以監測腫瘤轉移。因此，在轉移灶發生前，通過內窺鏡檢查原發灶的局部特性，待小鼠活體成像確定轉移灶形成后，對小鼠行安樂死取材檢查轉移灶性質，兩者結合可更好地研究結直腸癌的局部免疫狀態及其他特性。

綜上所述，本研究探索了內窺鏡在造模以及腫瘤發生發展中的監測作用，盡管無法保證每只小鼠100%的成功率，但因其突出的優勢，仍具有廣闊的應用前景。

：

[1] Kuipers EJ, Rosch T, Bretthauer M. Colorectal cancer screening--optimizing current strategies and new directions[J]. Nat Rev Clin Oncol, 2013,10(3):130-142.

[2] 李姍姍,張慧超,徐丹,等.傳統結腸鏡檢查法的應用現狀[J].現代生物醫學進展,2017,17(6):1180-1182.

[3] 殷漢華,司丕成,楊四清,等.結腸鏡在結直腸癌并急性腸梗阻診治中的應用價值分析[J]. 河北醫學,2015,21(8):1449-1451.

[4] van Rijn JC, Reitsma JB, Stoker J, et al. Polyp miss rate determined by tandem colonoscopy: a systematic review[J]. Am J Gastroenterol, 2006,101(2):343-350.

[5] Becker C, Fantini MC, Neurath MF. High resolution colonoscopy in live mice[J]. Nat Protoc, 2006,1(6):2900-2904.

[6] 舒冰焰.經結腸鏡盲腸壁下注射小鼠結腸癌細胞株建立實體瘤模型[J].中國普外基礎與臨床雜志,2013,20(7):819.

[7] 文韻玲.結腸鏡、超聲內鏡及CTE在炎癥性腸病診斷中的價值研究[D].昆明：昆明醫科大學,2017.

[8] Spinzi G, Minoli G. A comparison of colonoscopy and double-contrast barium enema for surveillance after polypectomy[J]. Gastrointest Endosc, 2001,54(3):417-418.

[9] Hensley HH, Merkel CE, Chang WC, et al. Endoscopic imaging and size estimation of colorectal adenomas in the multiple intestinal neoplasia mouse[J]. Gastrointest Endosc, 2009,69(3 Pt 2):742-749.

[10] Durkee BY, Shinki K, Newton MA, et al. Longitudinal assessment of colonic tumor fate in mice by computed tomography and optical colonoscopy[J]. Acad Radiol, 2009,16(12):1475-1482.

[11] van Rijn JC, Reitsma JB, Stoker J, et al. Polyp miss rate determined by tandem colonoscopy: a systematic review[J]. Am J Gastroenterol, 2006,101(2):343-350.

[12] Schwegmann K, Bettenworth D, Hermann S, et al. Detection of early murine colorectal cancer by MMP-2/-9-Guided fluorescence endoscopy[J]. Inflamm Bowel Dis, 2016,22(1):82-91.

[13] Adachi T, Hinoi T, Sasaki Y, et al. Colonoscopy as a tool for evaluating colorectal tumor development in a mouse model[J]. Int J Colorectal Dis, 2014,29(2):217-223.

[14] Vaish V, Kim J, Shim M. Lentivirus-mediated somatic recombination and development of a novel mouse model for sporadic colorectal cancer[J]. Genes Chromosomes Cancer, 2016,55(7):577-590.

[15] Hung KE, Maricevich MA, Richard LG, et al. Development of a mouse model for sporadic and metastatic colon tumors and its use in assessing drug treatment[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2010,107(4):1565-1570.