miR-101對結直腸癌細胞放療敏感性的影響及機制探討

劉燕，劉鈞，何欣蓉，陳筱莉，蹇順海，張超，李學農

(1川北醫學院，四川南充637000；2南方醫科大學)

miR-101是微小RNA(miRNA)家族中的一員，具有高度保守的成熟序列。研究表明，miR-101在多種實體瘤如乳腺癌、肝癌、胃癌、食管癌、胰腺癌、骨肉瘤等組織中表達下調，與其靶基因在腫瘤細胞的增殖、分化、凋亡、遷移、侵襲轉移及其他過程中起著一定作用。在胰腺癌組織中，miR-101通過靶向作用于高遷移率族蛋白A2(HMGA2)而抑制上皮間質轉化過程[1]；在骨肉瘤細胞中，miR-101靶向抑制c-FOS來抑制腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲能力[2]。本課題組前期研究發現，miR-101能夠阻滯結直腸癌細胞周期、抑制細胞增殖、促進細胞凋亡，并可靶向調控Ras相關的C3肉毒素底物1(Rac1)表達[3～5]。在食管癌、卵巢上皮癌、胎兒型橫紋肌肉瘤、肝癌及侵襲性子宮內膜癌等腫瘤細胞中，miR-101通過下調EZH2表達而抑制腫瘤細胞的增殖、遷移能力，促進細胞凋亡，并能提高腫瘤細胞對化療藥物的敏感性[6～9]。2014年1月～2016年6月，我們觀察了miR-101對結直腸癌放療敏感性的影響，并探討其分子機制?，F報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株 結直腸癌細胞株SW620、SW480由本實驗保存，穩定過表達miR-101細胞株SW620(miR101-SW620)及其陰性對照GV209-SW620、穩定沉默miR-101表達細胞株SW480(SW480-miR101)及其陰性對照SW480-NC由本課題組前期構建。

1.1.2 試劑 RPMI1640培養基和胎牛血清均購自Hyclone公司；全蛋白提取試劑盒、BCA蛋白含量檢測試劑盒均購買于南京凱基生物科技發展有限公司，配膠試劑盒和抗體稀釋液均購買于碧云天生物科技研究所；上樣緩沖液和脫脂奶粉均購買于廣州威佳科技有限公司；Rac1、細胞分裂周期蛋白42(Cdc42)、人Ras同源基因家族成員A(RhoA)、DNA損傷標志性蛋白γ-H2AX、細胞凋亡標志性蛋白Caspase-3一抗購買于Epitomics公司，鼠抗人α-GAPDH、辣根過氧化物酶標記的山羊抗鼠和抗兔IgG(H+L)二抗均購買于北京中杉金橋生物技術有限公司；蛋白預染Marker和超敏發光液均購買于美國Fermentas公司。

1.2 細胞培養 將結直腸癌細胞株SW480、SW620、miR101-SW620、GV209-SW620、SW480-miR101、SW480-NC均接種于含10%胎牛血清的RPMI1640培養基，在37 ℃ 5% CO2下進行傳代培養，取生長狀態良好的細胞用于實驗。

1.3 細胞中Rac1、RhoA、Cdc42蛋白檢測 采用Western blotting法。收集各型直腸癌細胞，用PBS洗滌3次，加入蛋白裂解液，冰上放置30 min，超聲裂解10次左右。于4 ℃ 12 000 r/min離心20 min，吸出上清將其移至一新的1.5 mL Ep管中，使用BCA蛋白含量檢測試劑盒測定蛋白濃度。分別配制10%、12%SDS-PAGE的分離膠與5%SDS-PAGE的濃縮膠，每泳道上樣量為30 μg總蛋白；與5×SDS上樣緩沖液按4∶1混合，沸水煮5 min，冰上放置2 min。上樣后進行電泳，濃縮膠使用恒壓80 V，30 min；分離膠使用恒壓100 V，60 min。拆分凝膠夾層后，根據Marker所示條帶位置，準確切下目的條帶；PVDF膜在甲醇中浸泡1 min，轉移至轉膜緩沖液(甘氨酸2.9 g、SDS 0.375 g、甲醇200 mL、Tris堿5.8 g，再加水定容至1 000 mL)中浸泡。在轉移盒中組裝好轉印夾層，由負極到正極依次放入海綿墊、2層濾紙、凝膠、PVDF膜、2層濾紙和海綿墊。使用Bio-Rad微型電轉移系統(150 mA)于冰上進行電轉移，直到目的蛋白對應的Marker轉移至PVDF膜上。將PVDF膜從轉移夾層中取出，甲醇中浸泡1 min，置于濾紙上使其充分干燥。再把膜放置到甲醇中10 s，再將膜放置于清水中清洗3 min。將膜放入含有封閉液(用5%脫脂奶粉配制的PBST)的平皿中，室溫下搖床上緩慢搖動孵育1 h；取出PVDF膜，加入一抗后于4 ℃冰箱孵育過夜。次日取出膜，室溫下孵育30 min；用25 mL PBST進行3次洗膜，每次5～10 min。加入HRP標記的二抗，室溫下搖床上緩慢搖動孵育1 h；用PBST進行3次洗膜，每次5～10 min，最后使用Tanon化學發光儀進行發光。以目的蛋白與內參光密度比值表示目的蛋白相對表達量。

1.4 細胞照射與敏感性觀察 采用Siemens PRIMUS直線加速器，6 MV X射線照射，源皮距為100 cm，吸收劑量率為200 cGy/min，培養板(瓶)上覆蓋1.5 cm厚的補償膠(模擬皮膚)，培養板(瓶)置于水槽之上。取SW620、GV209-SW620、miR101-SW620細胞，分別給予0、2、4、6、8 Gy射線處理24 h，采用Western blotting法檢測γ-H2AX、Caspase-3，以其相對表達量判斷細胞放療敏感性變化，檢測方法同1.3。

1.5 照射后細胞Rac1、 RhoA、Cdc42蛋白檢測 采用Western blotting法，方法同1.3。

2 結果

2.1 miR-101對結直腸癌細胞Rac1、RhoA、Cdc42蛋白表達的影響 與SW620、GV209-SW620細胞比較，穩定過表達miR-101的miR101-SW620細胞Rac1、Cdc42、RhoA蛋白表達均降低(P均﹤0.05)；與SW480、SW480-NC細胞比較，沉默miR-101表達的SW480-miR101細胞Rac1、Cdc42、RhoA蛋白表達均增高(P均﹤0.05)。見表1。

表1 miR-101對結直腸癌細胞Rac1、Cdc42、RhoA蛋白表達的影響

注：與SW620、GV209-SW620比較，*P<0.05；與SW480、SW480-NC比較，#P<0.05。

2.2 miR-101對結直腸癌細胞放療敏感性的影響 隨著照射劑量增加，結直腸癌細胞γ-H2AX、Caspase-3表達均增高(P均﹤0.05)；與同等照射劑量下SW620、GV209-SW620細胞比較，穩定過表達miR-101的miR101-SW620細胞γ-H2AX、Caspase-3蛋白表達均增高(P均﹤0.05)。見表2。

2.3 miR-101對照射后細胞Rac1、Cdc42、RhoA蛋白表達的影響 隨著照射劑量增加，結直腸癌細胞Rac1、Cdc42、RhoA蛋白表達均降低(P均﹤0.05)；與同等照射劑量下SW620、GV209-SW620細胞比較，穩定過表達miR-101的miR101-SW620細胞Rac1、RhoA、Cdc42蛋白表達均降低(P均﹤0.05)。見表2。

3 討論

miRNA是非編碼小分子RNA家族，轉錄后可通過堿基互補方式與靶向蛋白編碼基因mRNA的3′UTR結合，引起其降解或抑制其翻譯，發揮類似癌基因或抑癌基因的作用。人類基因組中約1/3的蛋白編碼基因受miRNA調控，參與細胞增殖、代謝、分化、周期及個體發育等生命活動。

本研究結果發現，隨著照射劑量的增加，各型結腸癌細胞γ-H2AX蛋白表達水平增加，表明其DNA雙鏈斷裂(DSBs)程度加?。欢谕粍┝空丈鋾r，過表達miR-101的結腸癌細胞γ-H2AX蛋白表達水平增加更顯著，提示其DSBs程度加劇。Rogakou等[10]發現，細胞在受到電離輻射作用時，能迅速磷酸化H2AX保守羧基端尾部的Ser139殘基，從而形成γ-H2AX，由此可見DSBs能誘導產生γ-H2AX。從分子水平表明，miR-101可能增加結直腸癌SW620細胞的放療敏感性。同時發現，結腸癌細胞隨著照射劑量的增加，Caspase-3表達增加；并且，過表達miR-101的結腸癌細胞，Caspase-3表達水平增加最明顯。這從蛋白水平表明，miR-101可促進結直腸癌細胞凋亡，增強結直腸癌細胞對放療的敏感性。

表2 照射后各型結腸癌細胞γ-H2AX、Caspase-3、Rac1、Cdc42、RhoA蛋白表達比較

注：與SW620、GV209-SW620同照射劑量比較，*P﹤0.05；與同類型細胞上一照射劑量比較，#P﹤0.05。

Bao等[11]發現，miR-101通過調控MAPK/Erk及Smad信號通路抑制膽囊癌的轉移和侵襲。而miR-101是如何調控結直腸癌細胞的放療敏感性，有待進一步研究。本課題組前期研究發現，miR-101的靶基因是Rac1，過表達miR-101后Rac1的mRNA和蛋白表達水平均下調；沉默miR1-101后，Rac1的mRNA和蛋白水平表達均上調。進一步驗證了miR-101靶向調控Rac1，可在轉錄和翻譯水平調控Rac1的表達[3]。本研究發現，過表達miR-101可降低結腸癌細胞Cdc42、RhoA蛋白表達，而抑制miR-101表達后Cdc42、RhoA蛋白表達水平上調，其結果與Rac1一致。這表明miR-101可能通過Rac1/Cdc42/RhoA通路來調控結直腸癌細胞的生物學行為。取SW620、GV209-SW620、miR101-SW620細胞，分別給予0、2、4、6、8 Gy射線處理24 h；結果發現，隨著照射劑量增加，結直腸癌細胞Rac1蛋白表達降低；同一劑量下，過表達miR-101的結直腸癌細胞Rac1蛋白表達水平下降更為明顯。這表明miR-101可能是通過調控Rac1來增強結直腸癌細胞的放療敏感性。同時，檢測結果還發現Cdc42和RhoA的蛋白表達水平與Rac1一致，表明miR-101增強結直腸癌細胞的放療敏感性可能與Rac1/Cdc42/RhoA通路密切相關。Rho家族屬于Ras超家族, 主要成員有Rac、Cdc42和Rho(包括RhoA、B和C)三個亞家族。Rac1是Rho-GTPase家族的主要成員之一，其與腫瘤的發生、轉移、侵襲，細胞凋亡、周期調控和腫瘤新生血管的形成密切相關[12，13]?；罨腞ac1能引起肌動蛋白微絲聚集于質膜上，產生片狀偽足和膜多極化，從而促進腫瘤的生長轉移和侵襲[12]。Thomas等[14]研究發現，在髓系白血病中，通過下調Rac1/Cdc42蛋白的表達后，RhoA的表達活性受到抑制，從而抑制了p210-BCR-ABL介導的髓系白血病的增殖，表明Rac1/Cdc42/RhoA通路與髓系白血病的增殖密切有關。RhoA家族屬于Ras超家族中小分子量G蛋白。研究表明，在結腸癌、肺癌和肝癌等多種實體瘤中RhoA家族表達異常，與腫瘤的增殖、分化、黏附、侵襲性增加和異常定位等生物學行為密切相關[15，16]。目前已經證實，RhoA蛋白在肺癌、結腸癌、乳腺癌等多種腫瘤中均呈過表達，并作為乳腺癌重要的預后指標[17，18]。因此，我們推測miR-101可能是通過Rac1/Cdc42/RhoA通路調控結直腸癌細胞對放療的敏感性，而miR-101是如何調控結直腸癌細胞增強其對放療的敏感性，還有待于進一步的實驗研究。

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