丹參多酚對(duì)心肌纖維化的干預(yù)研究

徐為民，時(shí)景偉，孫 志

(吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院，吉林 長(zhǎng)春130033)

丹參具有擴(kuò)張冠脈、防治心肌缺血、心肌梗死、改善微循環(huán)和降低心肌耗氧等作用，目前已被廣泛應(yīng)用于心血管疾病的治療[1]。丹參提取物的主要有效成分包括丹參酮IIA、丹參素和丹酚酸三類(lèi)。其中丹參多酚屬丹酚酸類(lèi)，具有清除自由基和抑制氧化酶樣活性，故具有抗纖維化的藥理基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)從組織學(xué)變化角度觀察丹參多酚對(duì)異丙腎上腺素致小鼠心肌纖維化模型的改善作用。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

注射用丹參多酚酸鹽(上海綠谷制藥有限公司)，鹽酸異丙腎上腺素注射液(上海豐禾制藥有限生公司生產(chǎn))，Trizol試劑，逆轉(zhuǎn)錄酶(Invitrogen公司)，DNA聚合酶，TECHNE TC-312 PCR 擴(kuò)增儀(英國(guó))，凝膠圖像處理系統(tǒng)(Tanon GIS-1000，上海)，DHE(二氫乙啡啶，美國(guó)Sigma公司)，DAPI封片劑(美國(guó)Sigma公司)，冰凍切片機(jī)(德國(guó))，激光共聚焦顯微鏡(尼康A(chǔ)1R)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物造模與分組

雄性CD1小鼠30只，體重17-25 g(由吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)。分為正常對(duì)照組，模型組和丹參多酚組。每組10只適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，予模型組及丹參多酚組皮下注射異丙腎上腺素(10 mg/kg)復(fù)制心肌纖維化模型，丹參多酚組同時(shí)給予丹參多酚(8 mg/kg/天)尾靜脈注射。四周后處死小鼠，收集心臟常規(guī)制備石蠟切片，行HE染色、天狼星紅染色及UII(尾加壓素Ⅱ)mRNA、UT(尾加壓素受體)mRNA半定量RT-PCR。

1.3 氧化應(yīng)激原位檢測(cè)

各組取部分心臟做冰凍切片，厚度10 μm。切片滴入DHE(1 μmol/L)，避光孵育5 min，PBS沖洗后，用水溶性封片劑(含DAPI)封片，在激發(fā)光波長(zhǎng)分別為405 nm及561 nm的激光共聚焦顯微鏡下觀察藍(lán)色細(xì)胞核及紅色活性氧分子，每組隨機(jī)取5個(gè)畫(huà)面，應(yīng)用Image J圖像分析系統(tǒng)分析紅色熒光強(qiáng)度(平均光度值和熒光面積)，評(píng)估氧化應(yīng)激情況。

1.4 RT-PCR

Trizol 提取心臟總RNA，各取1 μg mRNA以oligo dT為引物在SuperⅡ逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。根據(jù)GenBank中登錄的小鼠內(nèi)參對(duì)照物GAPDH、UII及tGPR14 mRNA序列，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，GAPDH內(nèi)參基因上游5’-ACCACAGTCCATGCCATC AC-3’，下游5’-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3’； UII：Sense：5’-GAGCATTCCCTTCATCGTAG -3’Anti-sense：5’-CATAGCGTTCACTGCTCATT-3’，UT：Sense：5’-CTTTCACTCAGCACCTCAT -3’Anti-sense：5’-CTTAGTTTTTCTCCACACTGTT -3’。擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度分別為452 bp 、385 bp和211 bp。取5μl PCR產(chǎn)物進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳，紫外線透射反射分析儀上拍照。每組隨機(jī)取5個(gè)心臟進(jìn)行上述步驟。UII、UT表達(dá)量以UII、UT灰度值來(lái)表示，應(yīng)用ImageJ測(cè)算灰度值并做統(tǒng)計(jì)分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 HE染色結(jié)果

對(duì)照組心肌排列整齊，橫紋清晰，細(xì)胞核大小一致。模型組心肌細(xì)胞腫脹，細(xì)胞核大小不一，排列紊亂，可見(jiàn)纖維增生。丹參多酚組則組織壞死和纖維化程度較模型組明顯減輕。見(jiàn)圖1。

2.2 天狼星紅熒光染色結(jié)果

正常對(duì)照組無(wú)明顯膠原纖維紅染，模型組可見(jiàn)大片致密亮紅色膠原纖維，與背景對(duì)比明顯，丹參多酚組紅染膠原纖維數(shù)量較模型組明顯減少。見(jiàn)圖2。

圖1 HE染色結(jié)果(200X) A:對(duì)照組，B:模型組，C:丹參多酚組

圖2 天狼星紅染色結(jié)果(200X) A:對(duì)照組，B:模型組，C:丹參多酚組

2.3 DHE熒光染色結(jié)果

正常對(duì)照組可見(jiàn)極少量散在點(diǎn)狀活性氧分泌，模型組活性氧明顯增多，丹參多酚組較模型組明顯減少。見(jiàn)圖3、表1。

圖3 DHE染色結(jié)果(600X) A:對(duì)照組，B:模型組，C:丹參多酚組。藍(lán)色為細(xì)胞核，紅色為DHE標(biāo)記的活性氧。

組別平均灰度值面積百分比正常對(duì)照組797.46±6.540.11±0.02模型組795.74±9.561.14±0.04**丹參多酚組796.68±8.220.60±0.11##

2.4 UII 及UTmRNA表達(dá)

RT-PCR結(jié)果顯示，四周時(shí)模型組 UII mRNA及UT表達(dá)均明顯增高(P<0.01)，治療組有所下降但仍高于正常對(duì)照組(P<0.01)。見(jiàn)圖4，表2。

圖4 UII 及UTmRNA的表達(dá) 1：DNA marker,2：對(duì)照組，3：模型組，4：丹參多酚組

平均灰度值UⅡUT累積密度UⅡUT正常對(duì)照組60.24±3.9554.72±5.088331±192.813572.2±567.6模型組226.46±8.26**177.78±8.60** 28177±662.5**42414.2±619.6**丹參多酚組151.50±9.23##124.10±5.72## 24334±1066.8##32692.0±603.6##

3 討論

植物提取物對(duì)UII誘導(dǎo)的心肌纖維化具有改善作用，這已在多個(gè)研究中被證實(shí)[2，3]，丹參因具有抗氧化應(yīng)激作用[1]，而氧化應(yīng)激是心肌纖維化的主要機(jī)制[4]，可能為活性氧參與前纖維蛋白1抗體的表達(dá)及Akt-ERK-eNOS信號(hào)系統(tǒng)的活化[5]。故丹參延緩心肌纖維化進(jìn)程在理論上是可行的，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)小鼠組織學(xué)變化證實(shí)了該理論。

在本研究中，丹參多酚在減少膠原和心肌壞死范圍上均起到顯著作用，同時(shí)也使UII的表達(dá)明顯減少，UII則是多個(gè)試驗(yàn)證實(shí)的與纖維化明確相關(guān)的因素之一[6,7]。

本實(shí)驗(yàn)中丹參多酚能夠減少活性氧的產(chǎn)生，從而減輕氧化應(yīng)激程度?；钚匝跏侵干矬w內(nèi)含有氧原子且性質(zhì)活潑的一類(lèi)物質(zhì)的總稱(chēng)，主要包括超氧陰離子自由基(O2-)、過(guò)氧化氫(H2O2)、單線態(tài)氧分子(1O2)、羥自由基(OH-)、過(guò)氧化脂質(zhì)(ROO-)和次氯酸鹽(ClO-)等，活性氧主要是由分子氧經(jīng)線粒體呼吸鏈電子傳遞產(chǎn)生，能通過(guò)氧化應(yīng)激促發(fā)機(jī)體的氧化損傷，并作為第二信使參與多種疾病的調(diào)節(jié)[8]，是導(dǎo)致心肌纖維化的主要機(jī)制。目前熒光法是較為靈敏及易操作的活性氧檢測(cè)方法。

本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用的DHE主要用來(lái)標(biāo)定超氧陰離子，在心肌細(xì)胞內(nèi)超氧陰離子作用下，DHE能被特定波長(zhǎng)的激光激發(fā)而顯示紅色熒光[9,10]。在本實(shí)驗(yàn)可以看到，Sham組心肌也顯示出一定的紅色熒光，顯示在心肌組織有其他的自發(fā)熒光成分，在一定程度上影響的實(shí)驗(yàn)的客觀性。另有研究利用DHE染色離體心肌細(xì)胞獲得較強(qiáng)熒光信號(hào)[11]，間接說(shuō)明活性氧代謝速度快，利用組織切片技術(shù)獲得的活性氧信號(hào)弱于細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)。

丹參多酚酸鹽成分相對(duì)單一，質(zhì)量穩(wěn)定，故不良反應(yīng)相對(duì)較少，且價(jià)格相對(duì)低廉。希望本研究可以為更多中藥制劑治療心肌纖維化提供依據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

[1]楊志霞，林 謙，馬 利.丹參對(duì)心血管疾病藥理作用的文獻(xiàn)研究[J].世界中西醫(yī)結(jié)合雜志， 2012， 7 (2):93.

[2]Cheng X,Zhang J,Chen Z.Effects of Total Flavone from Rhododendron simsii Planch.Flower on Postischemic Cardiac Dysfunction and Cardiac Remodeling in Rats[J].Evid Based Complement Alternat Med，2017：5389272.

[3]Kim J,Sohn E,Kim CS,et al.Effect of KIOM-79 on Diabetes-Induced Myocardial Fibrosis in Zucker Diabetic Fatty Rats[J].Evid Based Complement Alternat Med,2013：547653.

[4]Rababa’h AM,Guillory A,Mustafa R,et al.The Potential Role of Oxidative Stress in Cardiac Hypertrophy:A Narrative Review[J].Curr Cardiol Rev,2018.doi:10.2174/1573403X14666180111145

207.

[5]Jin HY,Song B,Oudit GY,et al.ACE2 Deficiency Enhances Angiotensin II-Mediated Aortic Profilin-1 Expression,Inflammation and Peroxynitrite Production[J].PLoS ONE,2012,7(6):e38502.

[6]Esposito G,Perrino C,Cannav A,et al.EGFR trans-activation by urotensin II receptor is mediated by b-arrestin recruitment and confers cardioprotection in pressure overload-induced cardiac hypertrophy[J].Basic Res Cardiol,2011,106:577.

[7]Liu W,Han Q,Liu Q,et al.An investigation into the expression and mechanism of action of urotensin II in chronic pressure-overloaded rat hearts[J].Mol Med Rep,2015,12(5):6626.

[8]李震宇,李 靜,杜呂佩,等.硼酸及硼酸酯類(lèi)過(guò)氧化氫熒光探針的最新研究進(jìn)展[J].中國(guó)科學(xué):化學(xué),2012,42(12):1683.

[9]Coleman MC,Olivier AK,Jacobus JA,et al.Superoxide Mediates Acute Liver Injury in Irradiated Mice Lacking Sirtuin 3[J].Antioxid Redox Signal,2014,20(9):1423.

[10]Giam B,Chu PY,Kuruppu S,et al.N-acetylcysteine attenuates the development of cardiac fibrosis and remodeling in a mouse model of heart failure[J].Physiol Rep,2016, 4(7):e12757.

[11]Tang S,Wen Q,Liu P,et al.Effects of cryptotanshinone on the expression levels of inflammatory factors in myocardial cells caused by Ang II and its mechanism[J].Int J Clin Exp Med,2015,8(8):12617.