蘆丁與奧司他韋聯合對H1N1流感病毒神經氨酸酶的抑制作用

王心佳,于 淼,李源博,王 燁,于大海,毛春玲，全吉淑*,房學迅*

(1.延邊大學醫學院 生物化學與分子生物學,吉林 延吉133002；2.吉林大學分子酶學工程教育部重點實驗室,吉林 長春130023;3.吉林亞泰(集團)有限公司藥物研究與開發中心,吉林 長春130000；4.長春職業技術學院)

流行性感冒是由流感病毒所引起的一種急性呼吸道傳染病。流感在傳播過程中具有致病性強、潛伏期短、致死率高等特點,這些特點都對人類的健康構成巨大的威脅[1]。流感病毒是一種單股負鏈的RNA病毒,屬于正黏病毒科,流感病毒屬[2]。在流感病毒的表面分布著兩種糖蛋白,分別是：HA(血凝素)和NA(神經氨酸酶)。其中,NA在流感病毒對宿主細胞的侵染過程和子代病毒的釋放過程都起著關鍵的作用[3-6]。其原理為：流感病毒表面的HA可與宿主細胞表面的唾液酸受體以糖苷鍵的方式結合在一起,NA的作用表現為可切斷二者的連接,由此,流感病毒可脫離宿主細胞從而重新侵染其它宿主細胞進行復制,達到流感病毒繼續傳播的作用。所以,以NA為靶點的抗流感病毒藥物已經成為全球學者研究的重點。

中藥在我國有幾千年的歷史,我國在治療流感方面積累了大量的理論和實踐經驗。研究發現：連翹、金銀花、炙甘草、穿心蓮等數十種中藥對流感病毒都有一定的抑制作用[7]。研究表明,許多從中藥中分離出的中藥單體對NA具有抑制作用,包括揮發油類、芪類、生物堿類、黃酮類、多糖類和萜類化合物。其中黃酮類化合物對神經氨酸酶普遍具有抑制作用[7]。蘆丁是植物界分布較廣的一種黃酮類化合物,臨床上主要用于脆性增加的毛細血管出血癥。王艷芳等[8]研究表明蘆丁對流感病毒感染導致的小鼠肺部病變具有保護作用。丁玥等[9]研究結果表明,蘆丁僅在流感病毒感染后給藥后表現出抗流感病毒活性,說明蘆丁可能作用于流感病毒的釋放和擴散階段。

目前,對流感進行治療的藥物主要是奧司他韋。但在治療過程中發現,許多類型的流感病毒對奧司他韋都具有一定的抗藥性[10]。有臨床實驗表明早期適當隔離措施和中西醫結合救治,大多數患者可以康復,中西醫結合治療療效快,效果好,并且可以降低耐藥性的出現[11]。李效全等運用利巴韋林聯合雙黃連口服液抗病毒治療輕型甲型H1N1流感取得了良好的效果[12]。也有研究發現,兩種或多種NA抑制劑類藥物與奧司他韋聯合使用可以明顯降低流感病毒對奧司他韋的抗藥性,并可以增加在同等劑量下奧司他韋對NA的抑制率[13,14]。

本文主要研究了中藥單體NA抑制劑蘆丁與奧司他韋聯合使用對H1N1型流感病毒神經氨酸酶NA(N1)活性的影響。

1 材料與方法

1.1 主要儀器

公司儀器美國Bio-TekFLX800熒光酶標儀芬蘭Finnpipette雷勃微量移液器上海信誼微量振蕩器日本SANYO超低溫冰箱

1.2 實驗試劑與材料

蘆丁(20 mg)單體化合物購買自上海源葉生物科技有限公司,將購買的蘆丁標準品用 DMSO稀釋至濃度為20 mM,存放于1.5 ml離心管并置于4℃冰箱內保存。

NA底物MU-NANA(Cas:M8639)和MES均購買自Sigma公司。

達菲(奧司他韋)購買自大連博格林生物科技有限公司。

重組甲型流感病毒 H1N1 神經氨酸酶 (A/New Caledonia/20/1999 (H1N1))購買于北京義翹神州公司。

1.3 常用溶液配制方法

MES緩沖溶液：用100 ml去離子水將CaCl20.044 g,MES 0.64 g溶解,并調節pH值至6.5,即可配制出32.5 mM含有4 mM CaCl2的緩沖溶液,將其放置在4℃冰箱中留存備用。

1.4 實驗方法

1.4.1蘆丁與奧司他韋對H1N1流感病毒神經氨酸酶IC50的測定

首先我們加入體積分別為40 μl的N1和10 μl的蘆丁,使蘆丁在其混合液中的終濃度分別為0 μM,50 μM,100 μM,150 μM,200 μM。在37℃下孵育30 min,然后加入體積濃度各為50 μl 20 μM NA的特異性底物MU-NANA,使反應終體積為100 μl,每個蘆丁濃度重復4次。最后在酶標儀上檢測熒光強度,激發波長為360 nm,發射波長為450 nm,檢測8 min。取4次測定熒光強度平均值,繪制成橫坐標為抑制劑濃度,縱坐標為平均反應速率的擬合曲線,我們根據擬合曲線的擬合方程計算出抑制劑對H1N1流感病毒神經氨酸酶IC50值。(IC50值：當酶活性抑制百分數等于50時,此時抑制劑的濃度為此抑制劑對此種酶的IC50)。相同原理,我們加入體積為1 μl其分別為 0 nM,0.5 nM,0.75 nM,1 nM,1.25 nM,1.5 nM,1.75 nM,2 nM濃度的奧司他韋,同樣方法計算出IC50。

1.4.2蘆丁對H1N1流感病毒神經氨酸酶抑制類型的測定

本實驗研究中使用雙倒數作圖方式測定蘆丁對N1抑制類型。我們在酶標板中的每孔加入10 μl濃度為0.02U N1以及40 μl分別為0,50,100,150,200 μM濃度的蘆丁,輕微震蕩后在37℃下孵育30 min,每個濃度重復4次。接著每孔加入50 μl神經氨酸酶特異性底物,即MU-NANA,其底物濃度分別為0.5,1,1.5,2 nmol。最后使用酶標儀測定其各自的熒光值,激發波長360 nm,發射波長450 nm,共計測定8 min,記錄結果并取平均值。根據結果使用雙倒數作圖方式,即橫坐標為蘆丁濃度倒數,縱坐標為熒光強度的倒數,以此進行分析蘆丁對N1的抑制類型。

1.4.3蘆丁與奧司他韋聯合對H1N1流感病毒神經氨酸酶抑制效果測定

為了測定蘆丁與奧司他韋聯合使用對N1的抑制活性,我們測定了蘆丁與奧司他韋的聯合指數CI(combination index)(CI值可以將兩種或多種藥物混合后的效果進行定量的分析)。CI的計算公式如下公式：

實驗中我們添加體積為10 μl分別為 0.5倍,1倍,2倍,4倍IC50濃度的蘆丁與之對應同倍數IC50濃度的奧司他韋聯合,一并與體積為30 μl H1N1流感病毒神經氨酸酶混合,然后在37℃下孵育30 min,最后每孔加入50 μl 神經氨酸酶特異性底物MU-NANA(反應終體系為100 μl)檢測N1的熒光強度。實驗重復4次,取平均值。

表1 CI值與化合物相互作用的評判標準

2 結果

2.1 蘆丁與奧司他韋對H1N1流感病毒神經氨酸酶的抑制活性

我們配制分別為50,100,150和200 μM濃度的蘆丁與0.5,0.75,1,1.25,1.5,1.75,2 nM濃度的奧司他韋,根據結果分別計算其對N1抑制活性(IC50),見表2。

表2 蘆丁和奧司他韋對H1N1流感病毒神經氨酸酶抑制的IC50值

2.2 蘆丁對H1N1流感病毒神經氨酸的抑制類型

為了探究蘆丁對N1的抑制類型,我們分別用不同濃度的蘆丁,即0,50,100,150,200 μM蘆丁與N1作用,再分別用不同濃度底物,即濃度分別為0.5,1,1.5,2 nmol的MU-NANA,以此測定N1的反應速率,得到相對應的熒光值。通過不同的蘆丁濃度與反應速率的雙倒數曲線判斷蘆丁對N1的抑制類型。如圖1所示,橫坐標為抑制劑蘆丁濃度倒數,縱坐標為反應速率倒數,曲線相交于X軸負軸上,此結果說明蘆丁對N1是非競爭抑制,即抑制劑蘆丁結合在N1的非催化位點區域。

圖1 蘆丁對N1抑制類型的測定

2.3 蘆丁與奧司他韋在體外聯合使用對H1N1流感病毒神經氨酸酶的作用

為檢測蘆丁與奧司他韋聯合使用對NA的抑制活性,我們測定了不同濃度下的蘆丁與奧司他韋的聯合指數。根據蘆丁與奧司他韋對N1 IC50,確定蘆丁與奧司他韋的聯合濃度分別為各自0.25,0.5,1,2和4倍的IC50濃度。如圖2(A)所示,X軸表示奧司他韋濃度,Y軸表示聯合用藥對N1的抑制速率,兩條曲線分別表示蘆丁與奧司他韋聯合曲線和奧司他韋單獨作用于N1的曲線,可以得出,蘆丁與奧司他韋聯合使用抑制率強于單獨使用奧司他韋對N1抑制率；如圖2(B)X軸表示蘆丁濃度,Y軸表示奧司他韋濃度,通過圖中曲線我們得出蘆丁與奧司他韋聯合對N1是協同抑制的作用效果。聯合指數CI值如表3所示,在測試濃度下均小于1,同樣表示出蘆丁與奧司他韋聯合使用對H1N1流感病毒神經氨酸酶是協同的抑制作用效果。

圖2 蘆丁和奧司他韋聯合使用對NA的抑制活性

表3 蘆丁和奧司他韋聯合使用對N1的CI

3 討論

神經氨酸酶是流感病毒的一種重要膜蛋白,在流感病毒對宿主的早期侵染定位和子代病毒的釋放過程中都起著關鍵的作用。因此,對于NA抑制劑的研究成為研究抗流感藥物的熱點[15]。

達菲是目前為止治療流感病毒最有效的藥物,但是隨著其廣泛的使用,抗藥性流感病毒已經出現的越來越頻繁。在H1N1中的H275Y是奧司他韋的抵抗型病毒,對奧司他韋的敏感性有了些許程度的降低[16]。并且達菲的使用過程中發現,對兒童的治療可能導致其死亡[17]。而在實際治療過程中發現,一些復方藥物或者聯合使用的藥物,可以明顯增強藥物的治療效果,或者降低達菲的使用量減少達菲對人體的損傷。葛資宇等[18]研究發現麻杏石甘湯與奧司他韋聯合用藥對A型流感病毒感染小鼠有保護作用,能抑制流感病毒感染所致的體重下降,降低肺指數,減輕肺組織病理損傷,效果優于麻杏石甘湯組,聯合用藥組能提高脾指數、胸腺指數,效果優于奧司他韋組。李健猴等[19]研究表明黃芩苷與帕拉米韋聯合抗流感作用比單獨使用效果好,在臨床上具有重要的應用價值。

本課題組的研究驗證了蘆丁是對N1具有抑制活性的單體。本課題組通過生物信息學的方式,利用計算機分子模擬對接方法發現：配體結構蘆丁還可成功對接在受體H1N1流感病毒神經氨酸酶生物大分子的非活性區域,類屬非競爭性抑制作用。酶學實驗與生物信息學方式都驗證了蘆丁對N1是非競爭性抑制作用。奧司他韋對N1是競爭性抑制作用[20]。二者分別結合在N1的不同位點,從而為蘆丁與奧司他韋聯合對N1抑制作用的探究奠定了基礎。

我們對蘆丁與奧司他韋進行了聯合指數的測定,以此來確定兩種藥物的聯合使用能否促進奧司他韋對N1抑制活性。首先找出N1的最適濃度,即N1濃度與活性成線性關系時其N1的最大濃度。我們測得其最適濃度為0.02U。隨后,我們又測定了蘆丁和奧司他韋對N1的IC50。然后,我們根據測定的蘆丁與奧司他韋對N1的IC50,確定了聯合使用時蘆丁與奧司他韋的濃度。最后,我們根據聯合使用對N1抑制的結果計算CI值,發現蘆丁與奧司他韋聯合使用表現出對N1協同抑制的作用效果。

蘆丁類屬維生素類藥,可使毛細血管通透性和脆性減弱,同時可保持及恢復毛細血管的正常彈性。在防治高血壓腦溢血,糖尿病視網膜出血和出血性紫癜等用途中較高,也用作食品抗氧劑和色素。可在蕓香葉、煙葉、棗、杏、橙皮、番茄、蕎麥花等植物中發現蘆丁。我們的研究表明,蘆丁在抗流感方面具有一定的應用價值。

藥物的聯合使用不僅僅是能夠降低對于患病者的使用量,而且在對于對某種特異性抑制的藥物來說,與不同藥物的聯合使用也能使其達到很好的治療效果。本研究為我們以后在臨床中治療流感提供了實驗的依據。

作者簡介：王心佳,女,碩士在讀,研究方向：天然分子生物活性研究;全吉淑,女,博士生導師、教授,研究方向：天然分子生物活性研究;房學迅,男,博士生導師、教授,研究方向：基質金屬蛋白酶的生物功能、酶抑制劑的發現與生物活性。

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